Per iniziare, raccogliere le PBMC trattate con il farmaco mediante centrifugazione e raccogliere il lisato cellulare in una piastra PCR. Centrifugare la piastra per raccogliere il lisato sul fondo. Successivamente, eseguire la denaturazione dell'mRNA utilizzando un termociclatore.
Quindi aggiungere sei microlitri della miscela di reazione della trascrittasi inversa a ciascun pozzetto per ottenere un volume totale di 12 microlitri. Sigillare la piastra per proteggerla dalla contaminazione e per evitare l'evaporazione. Centrifugare la piastra dopo averla brevemente vortexata.
Posizionare la piastra sul termociclatore e avviare il programma di reazione di trascrizione inversa. Dopo la trascrizione inversa, centrifugare la piastra PCR, aggiungere 15 microlitri della miscela di preamplificazione in ciascun pozzetto e sigillarlo. Posizionare la piastra sigillata sul termociclatore e avviare la reazione di preamplificazione.
Per ripulire il cDNA, aggiungere microsfere di purificazione magnetica a ciascun pozzetto e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra PCR su un rack magnetico per cinque minuti o fino a quando le perle non si separano. Successivamente, rimuovere con cautela il surnatante.
Mantenendo la piastra sulla griglia magnetica, introdurre delicatamente 100 microlitri di etanolo all'80% appena preparato per pulire le perle. Dopo un'incubazione di 30 secondi, utilizzare una pipetta per eliminare il surnatante. Lasciare asciugare le perline all'aria sulla griglia magnetica per cinque minuti o fino a quando l'etanolo non evapora completamente e le perline non appaiono più lucide.
Dopo aver rimosso la piastra dal rack magnetico, risospendere le perle in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Riposizionare la piastra sulla griglia magnetica fino a quando le perline non sono separate. Trasferire l'eluit su una nuova piastra PCR preparata per il controllo di qualità e la marcatura del cDNA.
Per la marcatura, aggiungere tre microlitri della miscela di marcatura per ciascuna reazione su una nuova piastra PCR. Aggiungi un microlitro di cDNA ad ogni reazione. Avviare immediatamente la reazione di tagmentazione.
Quindi neutralizzare la reazione aggiungendo un microlitro di tampone tagment neutralizzato a ciascuna reazione. Per la PCR di arricchimento, aggiungere nove microlitri della miscela di arricchimento PCR in ciascuna reazione per ottenere un volume totale di 14 microlitri. Avviare il programma di arricchimento PCR.
