Iniziare la procedura creando dei solchi di immobilizzazione nell'agarosio. Per fare ciò, riscaldare e mescolare il 2% di agarosio nel PBS, usando un microonde, fino a quando la soluzione non si è liquefatta. Pipettare 250 microlitri di agarosio liquefatto in un piatto con fondo di vetro.
E, usando un vetrino di plastica flessibile, appiattisci l'agarosio sul piatto. Una volta che l'agarosio si è raffreddato e si è completamente solidificato, utilizzare una pinza a punta fine per rimuovere il vetrino coprioggetto. Quindi, utilizzando un punzone da biopsia di tre millimetri, creare un foro nell'agarosio al centro del piatto.
Con l'aiuto di una salvietta delicata, rimuovere l'agarosio in eccesso. Conservare la muffa di agarosio, idratata con PBS, a quattro gradi Celsius, fino all'uso. Prima di montare la lente oculare specchiante isolata, aggiungere due millilitri del mezzo appropriato allo stampo di agarosio preparato, a seconda del tipo di lente.
Usando una pinza per embrioni, trasferisci delicatamente il cristallino fisso o vivo nel divot dell'agarosio. Quindi, posizionare il piatto su un tavolino da microscopio capovolto. Verificare che la lente sia situata con la regione anteriore rivolta verso l'obiettivo, visualizzando la colorazione dei nuclei.
Se non si osservano nuclei, utilizzare una pinza curva per ruotare delicatamente la lente di circa 180 gradi, in modo che la regione anteriore sia rivolta verso l'obiettivo. Successivamente, procedere all'acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio confocale. Per la visualizzazione delle capsule dell'obiettivo, acquisire immagini Z-stack utilizzando un obiettivo 40x, con una dimensione del passo di 0,3 micron.
Acquisire la prima immagine prima della superficie della capsula del cristallino, indicata dalla colorazione WGA, e l'ultima immagine dopo la superficie apicale delle cellule epiteliali. Per visualizzare le cellule epiteliali, acquisire immagini Z-stack utilizzando un obiettivo 63x con una dimensione del passo di 0,3 micron.
