Iniziare l'intera preparazione dell'innesto della lente fissa creando cunei di agarosio di immobilizzazione. Per fare ciò, prendi un piatto con fondo di vetro e versaci dentro circa cinque o sei millilitri di agarosio fuso al 2%, in PBS. Attendere che l'agarosio si solidifichi.
Quindi, usa una lama affilata per creare un avvallamento triangolare nell'agarosio solidificato. Rimuovere lo spicchio di agarosio e aggiungere un millilitro di PBS al piatto. Aspirare l'agarosio residuo rimasto dopo il taglio.
Crea più spicchi in un unico piatto per adattarlo a più lenti, se necessario. Per conservare lo stampo, aggiungi un millilitro di PBS prima di mantenerlo a quattro gradi Celsius. Usando una pinzetta curva, posiziona la lente nello spicchio di agarosio contenente un millilitro di PBS.
Regolare l'obiettivo in modo che la regione equatoriale sia rivolta verso il basso sul vetro del microscopio quando viene posizionata sopra l'obiettivo confocale. Posizionare il piatto sul tavolino del microscopio. Per confermare che la regione equatoriale è a fuoco, visualizza i nuclei, assicurandoti che siano allineati in file.
Inoltre, controlla le cellule epiteliali equatoriali di forma irregolare e le cellule della fila meridionale allineate con precisione e di forma esagonale, indicate dalla colorazione della F-actina sulle membrane cellulari. Un impacchettamento casuale dei nuclei nel campo visivo indica che la lente è rivolta anteriormente verso l'obiettivo. Se i nuclei non possono essere osservati, è probabile che il lato posteriore della lente sia rivolto verso l'obiettivo.
In questi casi, utilizzare una pinzetta curva per ruotare la lente fino a quando non si osservano i nuclei allineati con precisione all'equatore della lente.
