Per iniziare l'isolamento delle singole cellule dalle biopsie gastriche raccolte durante l'endoscopia superiore del paziente, in primo luogo, lasciare che il tessuto si depositi sul fondo di un tubo conico da 15 millilitri. Una volta stabilizzato, utilizzare una pipetta per aspirare il terreno e lavare le biopsie due volte con un millilitro di PBS integrato con antibiotici. Trasferire un minimo di 20 milligrammi di tessuto in una provetta da 1,5 millilitri contenente un millilitro di PBS integrato con DTT.
Usa le forbici per dissezione fine per tagliare il tessuto in pezzi di uno o due millimetri o più piccoli. Utilizzare una mini-centrifuga da tavolo per 15 secondi per aggregare i pezzi di tessuto sul fondo della provetta, quindi aspirare quanto più surnatante possibile. Aggiungere cinque millilitri di tampone di digestione appena riscaldato a una provetta conica da 50 millilitri.
Trasferire 500 microlitri di tampone da questa provetta alla provetta da 1,5 millilitri contenente i pezzi di tessuto. Successivamente, utilizzando le forbici, tagliare il puntale della pipetta da 1.000 microlitri dal basso per aumentare il diametro del puntale e ridurre al minimo la perdita di tessuto. Ora, con la punta della pipetta modificata, trasferire i piccoli pezzi di tessuto dalla provetta da 1,5 millilitri al tampone di digestione nella provetta da 50 millilitri.
Incubare il tampone di digestione e la miscela tissutale a 37 gradi per 30 minuti con agitazione orbitale a 200 giri/min. Quindi, aggiungere cinque millilitri di tripsina riscaldata con EDTA allo 0,25% al tessuto nel tampone di digestione e incubare. Neutralizzare il tampone di digestione e la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno DMEM/F-12 avanzato e far passare la sospensione attraverso un colino cellulare da 70 micron.
