Dopo che gli organoidi gastrici derivati dal paziente sono pronti per il confezionamento, iniziare il passaggio di routine degli organoidi. Innanzitutto, rimuovere il terreno da ciascun pozzetto, contenente gli organoidi, incorporati nella matrice della membrana basale, nella piastra a 24 pozzetti. Quindi erogare un millilitro di terreno di coltura Advanced DMEM F12 ghiacciato, direttamente su una cupola a matrice di membrana basale.
Continuare ad aspirare ed erogare il supporto, fino a quando tutti i frammenti della cupola non si staccano dalla piastra. Quindi trasportare sia il terreno che la matrice di membrana basale frammentata dal pozzetto al pozzetto successivo e ripetere il processo per tutti i pozzetti previsti per il confezionamento. Dopo aver smontato l'ultima cupola della matrice della membrana basale, erogare il terreno e la miscela in un tubo da 1,5 millilitri.
Collegare un puntale da 1000 microlitri a una pipetta P1000 e quindi inserirlo in un puntale da 200 microlitri. Utilizzando questa configurazione di pipette, pipettare vigorosamente la miscela di matrice organoide su e giù, circa 25 volte per frammentare gli organoidi in piccoli pezzi. Centrifugare la miscela di organoidi frammentata, utilizzando una centrifuga da tavolo a quattro gradi Celsius per 30 secondi a 2000 G.Utilizzando una pipetta, aspirare il terreno e il surnatante della matrice della membrana basale.
Aggiungere il volume calcolato della matrice di membrana basale fresca agli organoidi pellettati nella provetta. Pipettare delicatamente il contenuto della provetta su e giù per mescolare. Aliquote rapide, 50 microlitri della miscela di matrice organoide in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
Coprire immediatamente la piastra e capovolgerla con un unico movimento fluido. Posizionare la piastra invertita in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius per 35 minuti per consentire la polimerizzazione della matrice della membrana basale. Infine, aggiungere 500 microlitri di terreno organoide gastrico preriscaldato a ciascun pozzetto.
Entro il giorno 20 dopo l'iniziazione, gli organoidi erano pronti per essere attraversati, indicati da un organoide di grandi dimensioni o da un interno oscurato. Gli organoidi lasciati andare oltre questi punti, cominciarono a scomporsi in monostrati 2D. Dopo il confezionamento e la risemina gastrica, le cupole contenevano molti frammenti di organoidi che si riorganizzavano in molti altri organoidi molto rapidamente.
