Per iniziare, posizionare i vetrini coprioggetti sterili nei pozzetti delle piastre di coltura tissutale a sei pozzetti e versare un volume adeguato di poli-L-lisina e soluzione laminata nei pozzetti per coprire il vetrino coprioggetto. Quindi, sigilla la piastra con pellicola trasparente per ridurre l'evaporazione e incuba a quattro gradi Celsius per una notte. La mattina successiva, lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS sterile.
Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare e terreno di coltura alla piastra 10.000 cellule in ciascun pozzetto contenente il vetrino coprioggetto. Dopo aver lavato i vetrini coprioggetti con PBS, fissare le celle con una soluzione di paraformaldeide al 4% e PBS per 18 minuti. Sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS per cinque minuti prima dell'immunocolorazione.
Incubare i vetrini coprioggetti immunocolorati e lavati in uno o cinque microgrammi di colorante Hoechst per 10 minuti. Quindi lavare i vetrini coprioggetti con PBS per altri cinque minuti. Montare i vetrini utilizzando un rapporto uguale di PBS e miscela di glicerolo e acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Trattare le cellule con una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per 30 secondi a un minuto. Quindi aggiungere cinque millilitri di DMEM per ogni millilitro del reagente di dissociazione cellulare non enzimatica. Conta le cellule usando un emocitometro.
Centrifugare le celle a 5G per cinque minuti. Risospendere le cellule ad una concentrazione di una o due volte 10 delle sesta cellule per 100 microlitri di DMEM. Posizionare l'animale a pancia in giù e sterilizzare il sito di iniezione con etanolo al 70%.
Iniettare una o due volte 10 delle sesta cellule per via sottocutanea nel fianco destro. Metti il topo da solo in una gabbia senza lettiera e lascialo riprendere. Per prevenire l'ipotermia, posizionare una parte della gabbia sul termoforo.
Vengono mostrate immagini a bassa e alta potenza di cellule MPNST P0 GGF beta 3 di passaggio iniziale. Si è scoperto che le cellule sono tumoregeniche, formando colonie in agar molle e innesti in topi immunodeficienti.
