Prima del passaggio cellulare. rivestire una piastra a sei pozzetti con una soluzione di rivestimento a freddo e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un'ora, aspirare il terreno di coltura delle cellule staminali dalla piastra a sei pozzetti contenente cellule staminali pluripotenti umane e aggiungere un millilitro di DPBS privo di calcio e magnesio in ciascun pozzetto. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di soluzione di dissociazione in ciascun pozzetto e incubare per due-cinque minuti a temperatura ambiente.
Nel frattempo, aspirare la soluzione di rivestimento dalla piastra a sei pozzetti e aggiungere un millilitro di DPBS privo di calcio e magnesio in ciascun pozzetto. Sotto un microscopio invertito, osserva il processo di dissociazione cellulare. Quando l'80-90% delle cellule sembra essere arrotondato e aderente, aspirare la soluzione di dissociazione dai pozzetti della piastra a sei pozzetti.
Quindi aggiungere un millilitro di terreno per cellule staminali contenente 10 inibitori di rocce micromolari nella piastra a sei pozzetti. Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare dissociata in una provetta. Quindi, aggiungi un volume uguale di blu di tripano.
Mescolare delicatamente e contare le cellule con un emocitometro. Dopo il conteggio delle cellule, aggiungere due millilitri di terreno di coltura per cellule staminali per pozzetto contenente da 0,8 a 1 volte 10 al 6° cellule per millilitro e 10 inibitori della roccia micromolare. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro, da un lato all'altro, tre volte.
Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica al 5%. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro 10 volte prima di incubarla per due ore. Scongelare sia il terreno basale per il giorno zero e quattro che gli integratori sul ghiaccio.
Scaldare due millilitri al giorno, uno medio e uno di lavaggio medio in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, aspirare il terreno delle cellule staminali dai pozzetti di una piastra a sei pozzetti e aggiungere due millilitri di mezzo di lavaggio. Dopo aver aspirato il mezzo di lavaggio uno, aggiungere immediatamente due millilitri di mezzo del primo giorno a lato del pozzetto.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 24 ore. Il giorno 12 del processo di differenziazione, trattare una piastra a sei pozzetti contenente micropozzetti da 400 micrometri con due millilitri di soluzione di risciacquo antiaderenza. Sotto un microscopio invertito, osservare la piastra per le bolle.
Se non si osservano bolle, aspirare la soluzione di risciacquo antiaderenza e aggiungere immediatamente due millilitri di mezzo di lavaggio due. Quindi, aspirare il terreno progenitore pancreatico e aggiungere 0,5 millilitri di tampone di dissociazione per pozzetto. Incubare le cellule a temperatura ambiente per due-cinque minuti.
Quando la maggior parte delle cellule sono arrotondate e sono ancora aderenti, aspirare il tampone di dissociazione e aggiungere immediatamente un millilitro di terreno caldo a ciascun pozzetto. Utilizzando un puntale per pipette P1000, dissociare delicatamente le cellule, pipettando su e giù mentre si utilizza alternativamente un movimento circolare e ci si sposta dall'alto verso il basso del pozzetto per staccare le cellule in modo uniforme in tutto il pozzetto. Trasferire la miscela di cellule dissociate in una provetta conica da 50 millilitri.
Aggiungere un millilitro del terreno di coltura nella piastra a sei pozzetti per raccogliere tutte le cellule rimanenti. Successivamente, aspirare il mezzo di lavaggio due dalla piastra a sei pozzetti per micropozzetti e aggiungere la sospensione cellulare dissociata. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo, utilizzando un puntale per pipette P1000, raccogliere lentamente i cluster dalla piastra a sei pozzetti del micropozzetto in una provetta conica da 50 millilitri. Aggiungere un millilitro di terreno del giorno 13 per raccogliere i grappoli rimanenti e trasferire i grappoli nella provetta. Lasciare che le cellule si adattino naturalmente per gravità sul fondo del tubo per cinque minuti.
Aspirare con cautela il surnatante dalla provetta senza disturbare i cluster cellulari. Quindi, aggiungi due millilitri di day 13 medium nel tubo. Mescolare delicatamente pipettando su e giù, evitando l'aspirazione di grappoli.
Trasferire la sospensione in una piastra a sei pozzetti a bassissima aderenza. Muovi rapidamente la piastra avanti e indietro, da un lato all'altro, sei volte. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Le immagini di immunofluorescenza dei cluster hanno mostrato una predominanza di cellule produttrici di insulina che co-esprimono i marcatori delle cellule beta pancreatiche. L'espressione dei geni della firma delle cellule beta ha rivelato circa il 25% delle cellule che esprimono Nkx6.1 e il 40% che esprimono Pdx1. Durante il test di secrezione di insulina stimolata dal glucosio, i cluster derivati da MEL1 hanno secreto livelli significativamente più elevati di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio elevate rispetto a concentrazioni di glucosio basse.
