Per iniziare, la coltura cellulare di Agrobacterium tumefaciens trasformata in serie di antibiotici selettivi integrati con piastre di lievito mannitolo agar. Incubare le piastre per una notte a 28 gradi Celsius in un'incubatrice permanente. Il giorno successivo, inoculare le colonie della coltura su 12,5 millilitri di miscela di brodo di lievito Mannitolo Luria-Bertani e incubare su un agitatore orbitale a 28 gradi Celsius per 16 ore a 250 giri/min.
Inoculare 12,5 millilitri del ceppo Agrobacterium LBA4404 in 112,5 millilitri di brodo di lievito mannitolo con antibiotici. Incubare la coltura su un agitatore orbitale a 28 gradi Celsius per 16 ore a 250 giri/min. Regolare la coltura durante la notte a una densità ottica di 0,4 con il brodo di coltura.
Quindi aggiungere 20 micromolari di acetosiringone prima dell'incubazione. Una volta che la coltura incubata raggiunge una densità ottica di uno, centrifugare per pellettare le cellule. Risospendere il pellet in soluzione di sospensione a una densità ottica di 0,6 e aggiungere 200 acetosiringone micromolare prima dell'incubazione.
Per l'agroinfiltrazione, raccogli piante di cacao legnose che hanno rami con foglie. Aggiungere 250 micromolari di acido jasmonico alla sospensione di Agrobacterium. Successivamente, installare un essiccatore con un vacuometro come camera a vuoto per misurare la pressione all'interno.
Posiziona un anello di salto per consentire il passaggio del ramo della pianta. Posizionare il becher con la coltura di Agrobacterium all'interno dell'essiccatore e posizionare il ramo tra l'essiccatore e il suo coperchio, con le foglie desiderate immerse nella coltura di Agrobacterium. Successivamente, utilizzare materiale da impronta in silicone per sigillare gli spazi tra l'anello di salto, il ramo della pianta e l'essiccatore.
Una volta che il materiale siliconico si è polimerizzato, chiudere l'essiccatore, senza lasciare spazi vuoti, quindi collegarlo alla pompa del vuoto. Avviare la pompa del vuoto fino a raggiungere meno 0.07 megapascal. Quando viene raggiunta la pressione desiderata, chiudere la valvola di pressione e spegnere la pompa per mantenere la pressione per cinque minuti.
Aprire la valvola di pressione in modo graduale e costante per ripristinare la pressione della camera. Dopo aver ripetuto l'infiltrazione altre due volte, staccare il ramo dalla sospensione cellulare. Pulisci le foglie infiltrate con acqua distillata, quindi posiziona le piante a 25 gradi Celsius al buio per 48 ore.
Dopo l'incubazione, esporre il tessuto infiltrato a un fotoperiodo di 16 ore di luce e otto ore di buio. Le foglie infiltrate delle piante appaiono più scure in alcune parti, indicative della penetrazione dell'Agrobacterium. Il sistema reporter utilizzato ha prodotto un accumulo di betalaina sulle foglie, che può essere facilmente osservato come pigmentazione rosso brillante ad occhio nudo.
È stato osservato che l'accumulo di betalaina varia con la vitalità tissutale.
