Per iniziare, scongelare i campioni di plasma sanguigno isolati a 37 gradi Celsius. Trasferire 100 microlitri di ciascun campione di plasma in provette da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di tampone HBSA privo di calcio a ciascuna provetta.
Centrifugare i campioni a 20.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante a 20 microlitri senza disturbare il pellet. Successivamente, aggiungere un millilitro di tampone HBSA privo di calcio a ciascuna provetta.
Quindi pipettare su e giù per ricostituire il pellet. Agitare ogni tubo per alcuni secondi per garantire una distribuzione uniforme delle vescicole extracellulari. Quindi centrifugare a 20.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Anche in questo caso, aspirare il surnatante a 20 microlitri senza disturbare il pellet. Quindi ricostituire il pellet in 80 microlitri di tampone HBSA privo di calcio. Pipettare la sospensione su e giù per ottenere una sospensione uniforme.
Per misurare l'attività del fattore tissutale della vescicola extracellulare, per prima cosa, pipettare 40 microlitri del campione di vescicola extracellulare in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Nel primo pozzetto, aggiungere 11 microlitri di un topo inibitorio anti-umano TF IgG. All'altro pozzetto, aggiungere 11 microlitri di IgG di controllo del topo.
Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri della soluzione di miscela di fattori in ciascun pozzetto. Coprire la piastra con pellicola, quindi incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius. Aggiungere 25 microlitri di tampone HBSA EDTA per fermare la generazione del fattore Xa.
Ricostituire il substrato cromogenico in acqua distillata ad una concentrazione di quattro millimoli. Ora aggiungi 25 microlitri di substrato cromogenico in ogni pozzetto. Coprite il piatto con pellicola e poi avvolgetelo in un foglio di alluminio.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, centrifugare la piastra a 1.500 g per un minuto per rimuovere eventuali bolle. Quindi posizionare la piastra in un lettore di piastre a 405 nanometri.
Utilizzare la curva standard generata con il fattore tissutale ricombinante relipidato per convertire la generazione del fattore Xa di ciascun pozzetto. Quindi calcolare la generazione del fattore Xa dipendente dal fattore tissutale. Sei donatori su 11 rispondevano con lipopolisaccaridi medio-alti, mentre cinque donatori su 11 rispondevano con lipopolisaccaridi bassi.
