Per iniziare, utilizzare una pipetta multicanale per pipettare 100 microlitri di cisteina da 10 millimolari nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti in una cappa sterile. Dopo aver incubato la piastra, aspirare accuratamente la soluzione dal pozzetto ed evitare di graffiare l'elettrodo. Sciacquare i pozzetti due volte con acqua deionizzata sterile.
Quindi, aggiungi 100 microlitri di collagene di coda di topo appena preparato una soluzione in ciascun pozzetto. Incubare bene la piastra per un'ora in condizioni di scarsa illuminazione prima di lavarla due volte con acqua deionizzata. Successivamente, trasferisci le cellule endoteliali cerebrali raccolte in un trogolo sterile fresco.
Con una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto completando la semina in 30 secondi, conservare un solo terreno di coltura per scopi di modellazione matematica. Su un adattatore per piastre a 96 pozzetti, spostare le clip rosse su ciascun lato verso l'esterno per consentire l'inserimento della piastra. Allineare con precisione il pozzetto A uno della piastra con la regione A uno dell'adattatore e applicare una leggera pressione sulla parte superiore della piastra per tenerla saldamente in posizione.
Quindi bloccare nuovamente le clip rosse. Premere set up per avviare lo strumento dopo aver chiuso l'incubatrice, tutti i pozzetti rilevati correttamente saranno indicati da un colore verde sulla mappa della piastra. Premere il pulsante di controllo per autenticare le letture dell'impedenza assoluta.
Ora usa il menu a discesa sotto la mappa delle piastre per selezionare il tipo di piastra utilizzata per l'esperimento. Selezionare la multifrequenza per misurare l'impedenza a varie frequenze di corrente alternata. Infine, fai clic sul pulsante di avvio per iniziare l'esperimento.
Lasciare proliferare le cellule fino a formare un monostrato ad alta resistenza, indicato da un aumento degli ohm. Assicurarsi che la crescita cellulare abbia raggiunto un plateau prima di preparare le soluzioni di trattamento. Per preparare le soluzioni di trattamento, posizionare i tubi a grappolo in polipropilene da 1,1 millilitri etichettati in piastre tubolari a strisce.
Aggiungere tre citochine o cellule da 50 microlitri nel tubo seguendo una mappa su piastra prefabbricata. Quindi mettili nell'incubatrice per riscaldarli. Sul software EIS.
Fare clic su pausa per interrompere temporaneamente l'esperimento in corso. Quando richiesto, aprire l'incubatrice e rilasciare con cautela entrambe le clip rosse tenendo ferma la piastra. Con l'esperimento ancora in pausa, trasferire la piastra nella cappa sterile.
Quindi rimuovere i tubi rimossi dal trattamento dall'incubatrice. Con una pipetta multicanale. Risospendere con cura il contenuto dei tubi strippati per il trattamento.
Ora pipettare 100 microlitri di trattamento dalle provette spellate e trasferirli nei pozzetti appropriati sulla piastra da 96 pozzetti, aggiungere solo terreno completo ai pozzetti privi di cellule. Cercare di completare il pipettaggio in meno di cinque minuti, poiché un raffreddamento eccessivo della piastra potrebbe influire sulla resistenza del monostrato di cellule endoteliali. Ricollegare la piastra trattata alla macchina, quindi verificare che l'impedenza del pozzetto dell'elettrodo sia valutata.
Verificare che siano state selezionate le impostazioni di acquisizione multifrequenza corrette e che sia stato selezionato il catalogo delle piastre. Quindi premere riprendi per continuare l'esperimento. Una volta che l'esperimento è progredito fino al punto finale desiderato, premere Fine per salvare automaticamente il file registrato.
Passa al file e fai clic su esporta dati per esportare i dati come file XLS o CSV per ulteriori analisi. L'aumento della resistenza è stato osservato nell'arco di 30 ore, indicando la fase di crescita delle cellule endoteliali. Durante la fase di crescita, le cellule si sono stabilizzate a diversi livelli entro 48 ore, la normalizzazione della misurazione ha permesso un'interpretazione più affidabile delle variazioni di resistenza.
Un numero errato di cellule endoteliali cerebrali prima del trattamento ha provocato una fase di crescita fluttuante, che è gradualmente diminuita in un plateau di resistenza stabile. L'ottimizzazione della densità di semina delle cellule e del volume di carico ha portato a una fase di crescita ottimale. Le citochine sembravano avere un effetto transitorio sulla barriera.
L'aggiunta di cellule di melanoma ha ridotto drasticamente la resistenza della barriera. La barriera paracellulare e la componente basolaterale fluttuavano con l'aggiunta delle citochine, l'aggiunta di cellule di melanoma ha comportato una maggiore entità di diminuzione della barriera paracellulare rispetto alla componente basolaterale.
