Per iniziare, nella cappa sterile, avvitare in autoclave vasi a 24 pozzetti nel modulo cella sterilizzata con etanolo. Aggiungere 900 microlitri di terreno di base in ogni pentola. Collegare ora magneticamente gli elettrodi di immersione dell'autoclave al coperchio del modulo cella.
Quindi chiudere il coperchio sopra i pozzetti in modo che gli elettrodi a immersione si inseriscano nei contenitori inferiori degli elettrodi. Quindi, collegare il modulo cella all'adattatore in un'incubatrice. Quindi avvia il software e fai clic sulla scheda del layout per caricare e annotare la mappa sperimentale della targa.
Utilizzare una piastra di coltura sterile a 24 pozzetti per contenere gli inserti della membrana. Se è richiesto il rivestimento, aggiungere una soluzione di matrice extracellulare all'intersezione del pozzetto Con una pipetta a canale singolo, seminare con cura le cellule endoteliali cerebrali nella camera apicale di ciascun inserto del pozzetto. Per creare un pozzetto privo di cellule, pipettare solo il terreno completo in uno degli inserti.
Quindi trasferire il modulo cellulare dall'incubatore in una cappa sterile. Utilizzando una pinzetta, trasferire con cura gli inserti preparati nei contenitori degli elettrodi. Riposizionare il modulo cella nell'incubatore sopra l'adattatore.
Quindi individua la sezione dello spettro nella scheda di controllo dell'esperimento e seleziona Inizia a un hertz e fermati a 100 kilohertz per acquisire dati sull'intera gamma di frequenze. Quindi, sotto il tempo di attesa, selezionare 15 minuti per consentire misurazioni continue alla velocità più veloce. Premere start per avviare la raccolta dei dati.
Dopo circa 48 ore, una volta raggiunto un plateau nella resistenza endoteliale, porre i trattamenti preparati in un'incubatrice per mantenere una temperatura ottimale. Rimuovere il modulo cella a un tempo di trattamento selezionato che inizia immediatamente dopo una misurazione di 15 minuti. In una cappa sterile, aprire il modulo cella.
Quindi pipettare con cura 70 microlitri di trattamento nella camera apicale del rispettivo inserto. Restituire immediatamente il modulo cella all'adattatore prima dell'inizio della misurazione successiva. Per terminare l'esperimento, premere il pulsante di arresto, quindi fare clic su file, seguito da Esporta per esportare i dati direttamente in un file XLS e denominarlo in modo appropriato.
Sebbene sia stata osservata una certa variazione tra i pozzetti replicati, la normalizzazione dei dati ha ridotto questa variazione e ha consentito un migliore confronto del trattamento con il controllo. Una diminuzione transitoria della resistenza elettrica trans endoteliale è stata osservata quando sono state aggiunte citochine. Le linee cellulari di melanoma hanno causato una sostanziale diminuzione della resistenza entro cinque ore.
