Iniziare placcando le celle SHSY 5Y in piastre di celle con fondo di vetro a una densità di 15 per 10 raggi alla potenza di quattro celle per millilitro. Trattare le cellule con acido all-trans retinoico in terreno di coltura contenente FBS all'1% per cinque giorni, seguito da un trattamento con fattore neurotrofico derivato dal cervello per due giorni. Quindi, lavare le celle con PBS sterile.
Trattare le cellule per 72 ore con 10-7 agonisti molari dell'artrite reumatoide o isoforme utilizzando parti uguali di MEM e terreno F12 combinato con l'1% di FBS. Sostituire il terreno con terreno di coltura fresco contenente FBS all'1% mescolato con 20 nano molari TMRM per 45 minuti. Mettere le cellule in un'incubatrice collegata a un microscopio confocale a scansione laser impostato a 37 gradi Celsius.
Cattura le immagini utilizzando un obiettivo apocromatico a immersione in olio 63x. Impostare le dimensioni dell'immagine su 512 x 512 pixel con un'apertura stenopeica di un'unità di area. Raccogli una serie temporale di 15 fotogrammi da cinque diversi campi visivi in ciascuna piastra cellulare e una pila Z di otto piani Z equidistanti.
Il file LSM risultante deve contenere dati relativi a ora, posizione e Z-stack.
