Per iniziare, prendi una provetta con organoidi derivati dal paziente o sospensione di PDO in una quantità uguale di estratti di membrana basale o BME. Utilizzando una pipetta da 20 microlitri, seminare cinque cupole da microlitri al centro di ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti preriscaldata. Dopo aver seminato tutti i pozzetti, posizionare il coperchio sul piatto e capovolgerlo delicatamente.
Incubare la piastra rovesciata a 37 gradi Celsius per 20 minuti nell'incubatore per colture tissutali per consentire alle cupole di solidificarsi. Capovolgere il piatto in modo che il coperchio sia rivolto verso l'alto. Quindi incubare di nuovo.
Dopo aver aggiunto coloranti fluorescenti e farmaci alle piastre contenenti le DOP. Posiziona il piatto nella citazione cinque. Avviare il software Gen5 e, nella finestra task manager, selezionare la modalità manuale dell'imager e fare clic su Acquisisci ora.
Nelle impostazioni, specificare l'obiettivo, il filtro, il formato della micropiastra e il tipo di recipiente, selezionare Usa coperchio e Usa velocità del supporto più lenta e fare clic su OK. Quindi scegli un pozzo di interesse. Selezionare il canale in campo chiaro, fare clic su esposizione automatica e regolare le impostazioni in base alle esigenze.
Successivamente, per impostare lo stack Z, espandere la scheda della modalità di imaging, selezionare Z stack e regolare la messa a fuoco utilizzando le frecce di regolazione della rotta fino a quando tutti i PDO non sono sfocati. Stabilisci questo punto come parte inferiore della pila Z e ripeti in senso inverso per impostare la parte superiore. Successivamente, impostare i canali fluorescenti aprendo la fase di modifica dell'imaging.
In Canali, selezionare il numero desiderato di canali, designare un canale per il campo chiaro e canali aggiuntivi per ciascun canale fluorescente. Chiudere la finestra facendo clic su OK, modificare il menu a discesa su GFP per impostare l'esposizione per il primo canale fluorescente, fare clic su Esposizione automatica e regolare le impostazioni di esposizione nella scheda Esposizione per ridurre il segnale di sfondo. Per copiare le impostazioni di esposizione nella scheda Modalità immagine, fare clic sull'icona Copia, quindi fare clic su Modifica passaggio di imaging per aprire una nuova finestra.
Nel canale GFP, fate clic sull'icona degli appunti nella riga di esposizione per aggiungere al canale le impostazioni per l'illuminazione, il tempo di integrazione e il guadagno della fotocamera. Ora fai clic sull'icona della fotocamera e scegli la pre-elaborazione dell'immagine in aggiungi fase di elaborazione. Nella scheda campo chiaro, deseleziona l'opzione Applica pre-elaborazione immagine.
Per ogni scheda del canale fluorescente, assicurarsi che l'opzione Applica pre-elaborazione immagine sia selezionata. Deselezionare, utilizzare le stesse opzioni del canale uno, quindi fare clic su OK per chiudere la finestra. Ora fai clic su Proiezione Z sotto la fase di aggiunta dell'elaborazione, regola l'intervallo di sezioni se necessario e chiudi la finestra facendo clic su OK.
Per impostare il protocollo per l'imaging cinetico, nella barra degli strumenti fare clic su set di immagini e, dal menu a discesa, scegliere Crea esperimento da questo set di immagini. Fare clic sulle opzioni sotto l'altra intestazione e selezionare la casella della procedura cinetica discontinua. In Tempo totale stimato, immettere il tempo di esecuzione per l'esperimento.
Chiudere la finestra facendo clic su OK. Inoltre, imposta la disposizione della piastra e il gradiente di temperatura in questo momento. Convalidare i passaggi di riduzione dei dati facendo clic sulle finestre.
Quindi vai su file e fai clic su salva protocollo con nome nella barra degli strumenti. Selezionare una posizione di salvataggio. Inserisci un nome per il file e fai clic su Salva.
Per iniziare l'imaging cinetico, caricare il protocollo nel software di pianificazione bio spa on demand e scegliere uno slot disponibile. Nella scheda delle informazioni sulla procedura, selezionare utente dal menu. Accanto allo slot del protocollo, fai clic su seleziona e scegli aggiungi una nuova voce.
Ora fai clic su seleziona accanto allo slot del protocollo. Fare clic su Apri per navigare e importare il protocollo nel software di pianificazione. Immettere il tempo di imaging richiesto per la lastra e fare clic su OK per chiudere la finestra.
In intervallo, immettere la frequenza di imaging desiderata, selezionare la pianificazione, la piastra o il recipiente per avviare la sequenza di convalida della piastra, fare clic su Sì per accettare questa pianificazione.
