Caratterizzazione delle cellule staminali CD34⁺ magneticamente isolate per studi cardiovascolari

Per caratterizzare le cellule staminali CD34+ isolate dall'aorta murina e dalle arterie mesenteriche, eseguire la coltura a blocchi tissutali e ottenere le cellule mediante separazione magnetica. Per rilevare la cellula endoteliale nell'espressione del marcatore cellulare dei fibroblasti dopo la differenziazione, osservare le cellule a un ingrandimento di 40x con eccitazioni laser di 488 nanometri. Dopo la tripsinizzazione delle cellule, pellettare mediante centrifugazione e risospendere in 100 microlitri di tampone di selezione.

Quindi incubarli con anticorpi monoclonali CD16/CD32 anti-topo a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere due microlitri di ciascun anticorpo monoclonale desiderato per la colorazione immunofluorescente e incubare nuovamente a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Lavare le celle due volte con un millilitro di tampone.

Dopo aver centrifugato le cellule come dimostrato, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone. Trasferire le cellule nei tubi di flusso e metterle in una ghiacciaia. Eseguire la citometria a flusso per verificare la percentuale di cellule differenziate.

La valutazione citofluorimetrica ha confermato l'elevata purezza delle cellule staminali isolate CD34+ della parete vascolare. La colorazione con immunofluorescenza cellulare ha mostrato che le cellule staminali CD34+ isolate esprimevano prevalentemente marcatori di cellule staminali, CD34, c-kit e Flk-1. La citometria a flusso ha anche confermato che le cellule staminali CD34+ isolate possedevano la capacità di differenziarsi in cellule endoteliali e fibroblasti in vitro.