Dopo 27 giorni dall'inizio della differenziazione epatica delle cellule staminali pluripotenti indotte umane, lavare le cellule con due millilitri di PBS per pozzetto. Preparare la soluzione enzimatica nel tampone ADS utilizzando i componenti indicati. Aggiungere un millilitro di soluzione per pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius su uno shaker rotante per circa due ore per staccare le cellule dalla piastra. Confermare il distacco delle cellule al microscopio, quindi pipettare la sospensione cellulare per disperderla in singole cellule e raccoglierle in una provetta da 50 millilitri contenente il terreno di maturazione degli epatociti. Centrifugare la sospensione cellulare a 200G per cinque minuti a 18 gradi Celsius.
E usando un aspiratore, rimuovere il surnatante. Per colorare i mitocondri delle cellule, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di maturazione degli epatociti contenente 100 TMRM nanomolari. Incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius proteggendole dalla luce.
Anche in questo caso, centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in uno o cinque millilitri di tampone ADS freddo contenente il 2% di FBS. Dopo il conteggio delle cellule, aliquotare 500.000 cellule in una provetta da 1,5 millilitri ed etichettarla come controllo anticorpale non primario. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 200 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
Aggiungere 100 microlitri di anticorpi primari diluiti per un milione di cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri e incubare su ghiaccio per 50 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare e lavare le cellule due volte con tampone ADS freddo contenente il 2% di FBS.
Ora aggiungi 100 microlitri di anticorpo secondario diluito per un milione di cellule all'anticorpo primario, cellule colorate o non colorate, e incuba per 30 minuti su ghiaccio. Anche in questo caso, centrifugare la sospensione cellulare e lavare le cellule due volte con tampone ADS freddo contenente il 2% di FBS. Dopo aver risospeso le cellule nel tampone ADS, filtrarle attraverso un colino a scatto e posizionare la provetta sul ghiaccio.
