Per iniziare, taglia la carta da filtro in una forma rettangolare di circa 17 x 20 millimetri e rimuovi i quattro angoli. Quindi, crea circa sette per 10 millimetri di centro cavo nella carta da filtro. Collegare un anello disponibile in commercio a uno strato di pellicola flessibile e creare un centro cavo nello strato di pellicola flessibile.
Metti un anello preparato in una capsula di Petri da 35 millimetri. Dopo la pre-coltura, recuperare l'uovo dall'incubatrice e posizionarlo sul suo asse lungo sul vassoio del cartone delle uova. Pulire l'intera superficie del guscio d'uovo con etanolo al 70% e lasciarlo riposare per 15 minuti.
Tieni l'uovo sul suo asse corto e rompilo sul fondo. Apri l'uovo su una capsula di Petri pulita da 100 millimetri per estrarne il contenuto. Utilizzando una pipetta, trasferire circa 10 millilitri di albumina sottile in una provetta da 15 millilitri per la coltura ex ovo.
Riempire il pozzetto centrale del piatto di coltura con albumina sottile. Usando carta velina, rimuovere delicatamente l'albumina densa attaccata alla membrana vitellina dell'embrione. Ora, fissa con cura la carta da filtro alla membrana vitellina, assicurandoti che l'asse del corpo dell'embrione sia allineato con il rettangolo centrale sulla carta da filtro.
Tagliare la membrana che circonda la carta da filtro con le forbici. Usando una pinzetta, allontanare delicatamente la carta da filtro isolata dal giogo in direzione obliqua. Capovolgere la carta da filtro per posizionare l'embrione con il lato dorsale rivolto verso il basso.
Immergere con cura l'intera carta da filtro da un lato dell'asse lungo nella capsula di Petri da 100 millimetri contenente il mezzo di lavaggio. Utilizzando una pipetta pulita, spruzzare delicatamente il mezzo di lavaggio parallelamente alla carta da filtro per rimuovere eventuali residui di tuorlo. Successivamente, rimuovere con cautela la carta da filtro dal mezzo di lavaggio e utilizzare la carta velina per assorbire il terreno in eccesso dai bordi dell'embrione.
Posizionare la carta da filtro con l'embrione sulla piastra di coltura, assicurandosi che il lato dorsale dell'embrione sia rivolto verso il basso. Trasferire il piatto di coltura nell'incubatrice sul palco per la coltura ex ovo. Riempi i piatti di coltura con un mezzo di lavaggio caldo.
Quando l'embrione raggiunge lo stadio di sviluppo desiderato, trasferire la carta da filtro con l'embrione nella capsula di coltura riempita con un terreno di lavaggio. Posizionare la capsula di coltura nell'incubatrice sul palco del microscopio Brillouin. Per il processo di calibrazione, misurare il segnale di Brillouin dell'acqua.
Quindi, misurare il segnale di Brillouin del metanolo. Nell'imaging in campo chiaro con un obiettivo quadruplo, regolare il punto di illuminazione laser sulla seconda coppia di somiti. Quindi, passa a una lente dell'obiettivo 40x ed esegui la regolazione fine del punto laser al centro del tubo neurale.
Sbloccare il raggio laser e regolare il piano focale. Scansionare l'embrione utilizzando uno stadio traslazionale bidimensionale e acquisire un'immagine di Brillouin della regione di interesse. Dopo aver completato la scansione, rimuovere con cautela la carta da filtro con l'embrione.
Utilizzare carta velina per assorbire il mezzo di lavaggio in eccesso dall'embrione. Rimettere l'embrione nel piatto di coltura riempito con albumina sottile per una coltura continua. Per la ricostruzione dell'immagine di Brillouin, caricare i dati del segnale dell'acqua e del metanolo.
Fare clic su Imposta regione e selezionare la regione con quattro punti per il calcolo dei parametri di calibrazione. Salvare i risultati della calibrazione. Caricare i dati di scansione degli embrioni e fare clic su Avvia per l'elaborazione dei parametri.
Infine, ricostruire l'immagine di Brillouin 2D in base agli spostamenti di Brillouin di tutti i pixel. Lo spostamento di Brillouin nel modulo longitudinale stimato della placca neurale rispetto al numero di somiti e al tempo di incubazione ha mostrato un aumento dello spostamento di Brillouin del tessuto durante la chiusura del tubo neurale.
