Iniziare rimettendo in sospensione il peptide MOG 35 55 liofilizzato in acqua. Diluire il peptide a 10 microgrammi per millilitro nel tampone di rivestimento prima dell'esperimento. Ora pipettare 100 microlitri della soluzione finale nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
Rivestire contemporaneamente un numero uguale di pozzetti con 100 microlitri di BSA disciolto nel tampone di rivestimento. Sigillare la piastra con una pellicola adesiva per evitare l'evaporazione e incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, eseguire tre lavaggi della piastra con 200 microlitri di PBS integrati con lo 0,5% di interpolazione 20.
Successivamente aggiungere 100 microlitri per pozzetto di una soluzione bloccante composta dal 3% di BSA in PBS. Incubare la piastra sigillata per un'ora a 37 gradi Celsius in un forno di ibridazione. Dopo l'incubazione, lavare la piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBST.
Diluire ogni campione di siero ottenuto dal sangue di topi immunizzati con EAE in soluzione bloccante e aggiungere 100 microlitri per pozzetto a entrambi i pozzetti rivestiti di MOG 35, 55 e BSA. Aggiungere lo stesso volume di soluzione bloccante ai pozzetti vuoti designati. Incubare la piastra sigillata per due ore a temperatura ambiente agitando costantemente.
Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatore e sciacquare la piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBST. Diluire l'anticorpo secondario coniugato HRP in una soluzione costituita da 0,2% BSA in PBST e aggiungere 100 microlitri a ciascun pozzetto. Incubare la piastra sigillata per un'ora a temperatura ambiente mantenendo un agitazione costante.
Lavare la piastra tre volte con 200 microlitri per pozzetto di PBST. Aggiungere 100 microlitri di tre, tre prime, cinque, cinque substrato di tetrametil benzidina prime a ciascun pozzetto. Incubare al buio da uno a cinque minuti monitorando lo sviluppo di un colore blu.
Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto in ogni pozzetto. Quindi utilizzare un lettore di piastre impostato a una lunghezza d'onda di 450 nanometri per misurare la densità ottica in ciascun pozzetto. I valori di densità ottica dei campioni EAE erano significativamente più alti rispetto ai campioni di controllo, indicando una robusta risposta delle immunoglobuline G contro il peptide MOG.
