Ceppi di Shigella a tre striature su piastre di agar contenenti colorante rosso Congo per garantire che le colonie siano virulente e per prevenire l'uso di colonie non virulente nei test di infezione. Per iniziare, prendete le colture di Shigella cresciute durante la notte e fatele vorticare. Aggiungere 100 microlitri di coltura a cinque millilitri di TSB fresco in una provetta di coltura.
Incubare le colture a 37 gradi Celsius agitando a 250 giri/min fino a raggiungere una densità ottica di 0,7 a 600 nanometri. Trasferire 2 volte 10 alle 8 unità formanti colonie di Shigella sottocoltivata in provette per microcentrifuga da 2 millilitri. Celle a pellet mediante centrifugazione a 17.000 g per due minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il surnatante. Aggiungere un millilitro di PBS caldo e risospendere accuratamente il pellet. Dopo aver centrifugato nuovamente la cella, risospendere il pellet in due millilitri di DMEM caldo e vorticare la sospensione cellulare.
Quindi aggiungere un millilitro di Shigella risossuin e un millilitro di DMEM a ciascun pozzetto di monostrati epiteliali del colon HT29 in piastre a sei pozzetti. Per garantire il contatto batterico con le cellule HT29, centrifugare le piastre a sei pozzetti a 2.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius. Incubare piastre a sei pozzetti a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per 45 minuti.
Per determinare il titolo dell'infezione batterica, preparare diluizioni seriali decuplicate di cellule Shigella risospese in PBS. Mettere a piastre 100 microlitri delle diluizioni 1 volte 10 a 5 e 1 volte 10 a 6 su piastre rosse Congo con TSB e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare i terreni da ciascun pozzetto.
Aggiungi un millilitro di PBS caldo a ciascun pozzetto e lava delicatamente. Quindi aggiungere due millilitri di DMEM caldo con 50 microgrammi per millilitro di gentamicina e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Lavare le cellule HT29 infette tre volte con un millilitro di PBS.
Aggiungere due millilitri di DMEM caldo con gentamicina a ciascun pozzetto e incubare per un massimo di 24 ore per la replicazione intracellulare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di PBS con 1% Triton X-100 a ciascun pozzetto per lisare le cellule HT29.
Quindi, utilizzando un raschietto per cellule o una punta di pipetta piegata, raschiare le cellule lisate dal fondo del pozzetto e trasferire la miscela in una provetta per microcentrifuga da 1,7 millilitri. Agitare ogni tubo per almeno 30 secondi per spostare ulteriormente la Shigella dalle cellule eucariotiche lisate. Preparare diluizioni seriali decuplicate dei lisati e del PBS.
Placcare 100 microlitri delle diluizioni seriali su piastre rosse Congo con TSB e incubare per una notte a 37 gradi Celsius.
