Creazione della mappa di navigazione per CLEM e preparazione delle sezioni ultrasottili per la microscopia elettronica

Per iniziare, prendi una sezione ultra sottile di tessuto cerebrale di topo che esprime mScarlet. Aggiungere 10 microlitri di tampone di montaggio sulla sezione ultrasottile del vetro di copertura e posizionare un nuovo vetro di copertura pulito sul tampone di montaggio. Mettere i due vetri di copertura con la sezione ultrasottile in una camera di imaging.

Individuare la sezione utilizzando il marcatore dell'anulus nella modalità di imaging in campo chiaro di un microscopio a fluorescenza invertita e spostarsi in un angolo della sezione. Accendi la luce bianca e cattura l'immagine in campo chiaro. Quindi spegni la luce bianca.

Attivare il laser e acquisire immagini fluorescenti dello stesso campo visivo. Disattiva il laser e spostati sul campo visivo adiacente con una sovrapposizione del 10%. Cattura sia il campo chiaro che l'immagine fluorescente del secondo campo visivo e registra il percorso di imaging per unire il campo visivo.

Ora usa la mappa di navigazione per scegliere come target le celle di interesse. Attiva il laser e cattura 300 fotogrammi di immagini fluorescenti della cellula di interesse. Quindi, disattivare il laser.

Successivamente, attivare la luce bianca e scattare circa 100 immagini sequenziali in campo chiaro. Per preparare le sezioni per la microscopia elettronica, riempire un barattolo di vetro con acqua bidistillata. Rimuovere i vetri di copertura che trattengono le sezioni ultrasottili dalla camera di imaging e separarli con una pinzetta.

Clamp il vetro di copertura con la sezione. Lavare via il tampone di montaggio con acqua bidistillata e lasciarlo asciugare. Usando una lama su un solo lato, incidete un hashish attorno alla sezione ultra sottile.

Far cadere 10 microlitri di acido fluoridrico al 12% in ogni angolo del punteggio. Immergere lentamente il bicchiere di copertura nell'acqua. Quindi far galleggiare il film Pioloform e la sezione ultra sottile sulla superficie dell'acqua.

Posizionate una griglia di asole non rivestita sulla sezione per catturarla al centro della griglia. Coprire un vetrino con paraforma. Prelevare la griglia con la pellicola Pioloform e lasciarla asciugare all'aria a temperatura ambiente.