Per iniziare, aggiungere un millilitro di matrice extracellulare all'1% a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Dopo un'ora, aggiungere due millilitri di terreno di mantenimento preriscaldato contenente 0,4 micromolari Y-27632 a ciascun pozzetto.
Per scongelare le cellule staminali embrionali H9, agitare il brodo criviale a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 30 secondi. Sterilizzare accuratamente il crioviale con uno spray alcolico disinfettante al 75%. Quindi trasferire le celle scongelate in una provetta da 15 millilitri contenente il mezzo di mantenimento e Y-27632.
Centrifugare la provetta a 190 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere con cautela la maggior parte del surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di terreno di mantenimento contenente Y-27632. Erogare 0,5 millilitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto della piastra rivestita di matrice extracellulare contenente il mezzo di mantenimento.
Agitare la piastra lateralmente e incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per almeno 24 ore. Cambia il mezzo ogni giorno. Una volta che la densità del clone raggiunge il 70%, rimuovere il terreno esausto.
Dopo i lavaggi del PBS 2D, incubare le cellule con un millilitro di EDTA per quattro-sette minuti a temperatura ambiente ed eliminare completamente l'EDTA. Aggiungere un millilitro di terreno di mantenimento alle celle e picchiettare delicatamente la piastra. Quindi trasferire le cellule rimosse in una provetta da 15 millilitri e mescolarle da tre a cinque volte.
Aggiungere da 20 a 100 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di un piatto rivestito di ECM precedentemente preparato e mescolare bene. Utilizzando un microscopio, confermare la densità cellulare e incubare le cellule a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica.
