Per iniziare, scongelare e coltivare cellule staminali embrionali H9 in un terreno di mantenimento contenente Y-27632. Il giorno zero, una volta che le colonie diventano confluenti al 70%, lavarle con 2 millilitri di DPBS, quindi incubare le cellule con 0,5 millilitri di soluzione di dissociazione cellulare contenente 20 micromoli per litro Y-27632. Per interrompere la digestione, aggiungere 3 millilitri di terreno di mantenimento contenente 20 micromoli per litro Y-27632.
Per pellettare le cellule, centrifugare la provetta a 190 G per cinque minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in un millilitro di terreno chimicamente definito privo di fattore di crescita con Y-27632. Dopo aver contato le cellule, aggiungere 1,2 milioni di cellule a 10 millilitri di terreno chimicamente definito privo di fattore di crescita e mescolare bene.
Quindi erogare 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra inferiore conica a 96 pozzetti. Incubare in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica. Per indurre la formazione della retina il sesto giorno, aggiungere terreno contenente BMP4 a ciascun pozzetto di una piastra con fondo a V a 96 pozzetti e incubare di nuovo.
Il novo, il 12° e il 15° giorno, sostituire metà del terreno esausto con terreno fresco senza BMP4. Il giorno 18, trasferire con cura i corpi embrioidi formati in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Dopo la precipitazione naturale dei corpi embrioidi, rimuovere delicatamente il surnatante e risciacquarli con il mezzo di differenziazione della retina neurale.
Quindi posizionare i corpi embrioidi in una piastra a sei pozzetti a basso assorbimento e incubare nuovamente la piastra. Il giorno 21, le immagini in campo chiaro hanno mostrato una struttura neuroepiteliale continua nella retina neurale generata utilizzando questo metodo. Il tasso di successo dell'induzione retinica era significativamente più alto e gli organoidi retinici generati utilizzando questo protocollo erano simili per dimensioni e morfologia rispetto ad altri metodi.
