Per iniziare, sterilizzare e sezionare gli occhi enucleati ottenuti da una macelleria ispezionata dall'USDA, per preparare la conchiglia oculare. Posizionare delicatamente la conchiglia oculare, con l'interno rivolto verso l'alto, nella capsula di Petri contenente il colino cellulare. Aggiungere DPBS raffreddato all'oculare, assicurandosi che il livello del fluido sia appena al di sotto del punto più basso dell'incisione.
Sotto una torcia, trova tutte le aree in cui la retina neurale sta iniziando a staccarsi dall'epitelio pigmentato retinico, quindi usa una pinzetta smussata per afferrare delicatamente la retina neurale sollevata e staccarla. Raccogli delicatamente la retina neurale vicino al disco ottico. Utilizzando una pipetta da pascolo collegata a un sistema di aspirazione sottovuoto, aspirare la retina neurale.
Aggiungere con cautela altri DPBS raffreddati per sostituire il volume aspirato. Ora, aspira questo DPBS aggiunto per rimuovere la retina neurale rimanente. Dopo aver rimosso la retina neurale da tutte le conchiglie oculari, aggiungere delicatamente tripsina a ciascuna conchiglia oculare e riposizionare il coperchio della piastra di Petri.
Incubare gli occhi con tripsina a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Sotto una torcia, usa una pipetta da mille microlitri per rimuovere delicatamente le cellule dell'epitelio pigmentato retinico da ciascun oculare. Trasferire le cellule rimosse in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Lavare l'oculare con terreni di coltura cellulare per raccogliere le cellule rimanenti e neutralizzare la tripsina. Mescolare queste cellule contenenti terreno con le cellule raccolte in precedenza. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare. Risospendere ogni pellet cellulare in tre millilitri di soluzione di lavoro per anasi D. Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 15 minuti.
Quindi, centrifugalo a 150 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di terreno di coltura cellulare fresco. Trasferire le cellule ottenute da due a tre occhi in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti e considerarlo come passaggio zero.
Quindi, trasferire con cura la piastra a sei pozzetti seminata in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Le cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico sono state isolate dagli occhi suini con una pigmentazione caratteristica evidente tre giorni dopo l'isolamento. Le cellule hanno raggiunto la piena confluenza dopo una settimana, indicativa di un monostrato sano.
Le colture che presentavano una morfologia anomala e un'eccessiva pigmentazione sono state riconosciute come contaminate e non utilizzate negli esperimenti.
