Per iniziare, prendi le cellule Calu6 trasfettate con EV-microRNA e microRNA cellulare coniugati con fluorofori. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un tappo filtrante da 35 micrometri incluso con i tubi FACS in polistirene a fondo tondo. Quindi installare lo strumento di citometria a flusso, accendere il citometro a flusso e lasciarlo riscaldare per 30 minuti prima dell'uso.
Adescare il sistema fluidico con fluido di guaina. Successivamente, verificare e regolare l'allineamento del laser. Per il controllo di qualità, caricare acqua filtrata ultrapura nel citometro a flusso e farlo funzionare a una portata adeguata, garantendo un tempo di acquisizione adeguato.
Quindi impostare la soglia per l'acquisizione del segnale dalle celle Calu6 a FSC 5, 000. Per tenere conto della sovrapposizione spettrale tra i fluorofori, preparare i controlli di compensazione utilizzando cellule non trasfettate e cellule trasfettate con un solo fluoroforo. Eseguire l'analisi dell'espressione nelle cellule trasfettate utilizzando i canali FSC, SSC, FITC e PE impostati rispettivamente a 258, 192, 269 e 423 unità di tensione.
Quindi introdurre il campione di controllo negativo nel citometro a flusso. Acquisisci i segnali delle celle dopo aver definito le intensità FSC e SSC in un foglio di lavoro personalizzato. Selezionare FSC per l'asse X e SSC per l'asse Y nel grafico.
Disegna un poligono attorno alla popolazione di interesse per creare un cancello sull'asse. Per creare un nuovo grafico utilizzando la popolazione controllata, impostare l'asse X sul segnale fluorescente 1. Per il rilevamento di microRNA cellulari e l'asse Y al segnale fluorescente 2 per il rilevamento di EV-microRNA.
Stabilire i parametri di compensazione per i singoli fluorofori utilizzando cellule trasfettate in modo indipendente con ciascuno dei microRNA marcati con fluorescenza. L'analisi della citometria a flusso di cellule trasfettate con microRNA cellulare e microRNA EV ha rivelato una diminuzione sequenziale del segnale di fluorescenza corrispondente al microRNA EV. Al contrario, il segnale corrispondente al microRNA cellulare è stato trattenuto nelle cellule, indicando che il fluoroforo non influisce sulla ritenzione dei microRNA da parte delle cellule.
