Per iniziare, prendi le vescicole extracellulari isolate dalle cellule Calu6, trasfettate con EV-micro RNA coniugato con fluorofori e micro-RNA cellulare. Diluire le vescicole extracellulari in un volume appropriato di PBS ultrafiltrato per preparare la sospensione della vescicola extracellulare per l'analisi della citometria a flusso. Utilizzare il citometro a nanoflusso per analizzare particelle di dimensioni nanometriche.
Avviare il software e configurare lo strumento in base alle istruzioni di calibrazione consigliate. Utilizzando le nanosfere ad alte prestazioni, condurre il test delle prestazioni. Le prestazioni dello strumento sono considerate ottimali se le nanosfere vengono rilevate all'interno dell'intervallo di dimensioni standard.
Determinare la portata adatta per il rilevamento di particelle EV. Ora, eseguire un controllo di qualità utilizzando acqua filtrata ultrapura per verificare la fluidica degli strumenti e valutare le prestazioni di rilevatori e laser. Configurare i parametri per valutare la sensibilità e la risoluzione di diverse popolazioni nella miscela di microsfere secondo il protocollo del produttore.
Quindi, applicare il gating appropriato per distinguere la popolazione di perline dal rumore dello strumento. Successivamente, eseguire un vortice accurato dei campioni per garantire una distribuzione uniforme delle vescicole extracellulari prima di caricarle per l'analisi. Avviare il software di analisi dei dati di citometria a flusso e introdurre PBS ultra-filtrato.
Utilizzando PBS ultrafiltrato, impostare il gating per le particelle EV assicurandosi che il gating corrisponda alla dimensione appropriata delle particelle in base alla calibrazione. Prendete le vescicole extracellulari che sono state trasferite e vorticate in un tubo compatibile sintonizzato e caricate il tubo nello strumento. Cattura i segnali EV tracciando FSC sull'asse x e SSC sull'asse y.
Per il rilevamento di micro RNA cellulari sull'asse x, selezionare il segnale di fluorescenza 1 e per il rilevamento di micro RNA EV sull'asse y, scegliere il segnale di fluorescenza 2. Utilizzando i campioni EV isolati da cellule trasfettate con un singolo micro RNA. Parametri di compensazione stabiliti per i fluorofori.
La citometria a flusso ha rivelato un accumulo dipendente dal tempo di miR-451a, Alexa fluor-488 nelle vescicole extracellulari che supportano un imballaggio e un rilascio efficienti. Al contrario, la fluorescenza della cellula miR-67 non è stata osservata nelle vescicole extracellulari.
