Per iniziare la coda G/I, preparare una miscela da 20 microlitri su ghiaccio con RNA totale, miscela tampone di coda e miscela di enzimi di coda. Incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti in un termociclatore. Quindi, aggiungere la soluzione di arresto della coda e tenere sul ghiaccio per due minuti.
Eseguire la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR. Dopo l'elettroforesi su gel ad alta risoluzione dei prodotti PCR, accedere ai dati utilizzando il software. Aprite il file XAD e selezionate i nomi dei campioni o la scala nel pannello Vista struttura.
Ingrandisci e rimpicciolisci gli elettroferogrammi e le immagini gelatinose per una visualizzazione dettagliata. Per ottenere le dimensioni dei picchi, aprire l'elettroferogramma di un campione selezionato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'elettroferogramma e selezionare l'integrazione manuale per selezionare manualmente i picchi trascinando la linea orizzontale.
Osservare i valori dei picchi nella tabella dei picchi e identificare il picco con l'altezza del picco maggiore. Abilita l'icona Mostra/Nascondi Setpoint nel menu in alto. Apparirà un nuovo pannello sul lato destro.
Selezionare Avanzate, scorrere verso il basso fino a Esegui analisi striscio e selezionare la casella di controllo. In questo modo la tabella Regione verrà aggiunta alla scheda Elettroferogramma. Quindi seleziona un elettroferogramma e vai alla tabella Regione.
Nel menu Da coppia di basi e Alla coppia di basi, impostare la coppia di basi iniziale e finale facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'elettroferogramma e selezionando una regione da aggiungere. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi cella nella tabella Regione e selezionare Modifica regioni per creare una nuova finestra popup per impostare le regioni personalizzate. Usa questa equazione per calcolare la lunghezza della poli(A)coda sull'mRNA di interesse.
Successivamente, nella scheda Elettroferogramma, selezionare Mostra dimensioni per convertire automaticamente la tabella Regione da coppia di basi a runtime. Aprire il file CSV e selezionare i valori ottenuti per il runtime per generare un grafico. Utilizzando questo protocollo, sono state analizzate le lunghezze della poli(A)coda dei geni Dscam1 e GAPDH dal cervello larvale di Drosophila, mentre i prodotti PCR da coppie di primer geneticamente specifici hanno mostrato una singola banda.
I prodotti della PCR delle coppie di primer universali geneticamente specifici hanno mostrato modelli di striscio distinti, indicando una lunghezza differenziale di poli(A) degli mRNA. Le lunghezze medie della poly(A)tail sono state ottenute utilizzando l'analisi dello striscio. E la gamma delle lunghezze della coda era rappresentata dagli elettroferogrammi.
Allo stesso modo, l'analisi della lunghezza della poli(A)coda sulle cellule S2 ha mostrato lunghezze differenziali della poli(A)coda per i geni SV43 prime UTR e GAPDH.
