Per iniziare, assicurarsi che il layout del microscopio sia preparato sulla superficie del tavolo ottico con tutte le distanze misurate accuratamente. Quindi montare il laser di eccitazione sul tavolo. Impostare due iridi all'altezza prevista del laser e utilizzare queste iridi per assicurarsi che il raggio sia livellato e centrato.
Posizionare lo stadio di traslazione, o TS1, sotto la posizione dello specchio 1 o M1. Utilizzare la coppia di diafrasi impostati all'altezza esatta per definire il percorso del fascio di uscita desiderato e guidare il posizionamento e l'allineamento di ciascun elemento riflettente. Quindi, posizionare M1 nella parte superiore del TS1. Quindi montare e allineare il dicroico sul tavolo.
Allo stesso modo, montare il galvo e allinearlo con le iridi. Una volta effettuati gli allineamenti, posizionare M2 quindi clamp M3 al tavolo. Regolare l'altezza e la posizione fino a quando la trave non è approssimativamente centrata su entrambi i dischi di allineamento in vetro smerigliato.
Aggiungere quindi i supporti a M3. Quindi, inizia a montare la lente 1 sul tavolo. Regolare l'inclinazione e la posizione laterale fino a quando la trave non è centrata sulle lastre di vetro smerigliato sopra M3. Posizionare la lente 2 e controllare la collimazione utilizzando uno specchio per far rimbalzare il raggio su una superficie lontana.
Utilizzare una scheda indice o un bersaglio per tracciare il raggio e assicurarsi che il raggio non cambi di dimensioni. Quindi regolare la posizione x, y del foro stenopeico con l'attacco XY e la distanza assiale con il tavolino unidimensionale per massimizzare la trasmissione. Regolare assialmente l'obiettivo 4 per focalizzare il fascio di eccitazione sulla superficie del galvo e disporre l'obiettivo 3 sul tavolo, seguito da SL1.
Regolare la distanza assiale di SL1 per formare un telescopio colato, con l'obiettivo 4, quindi posizionare TL1 parallelamente a SL1. Regolare l'altezza dell'obiettivo 1 sul sistema a gabbia fino a quando la trave non forma un disco d'aria sul soffitto. Continuare a regolare fino a ridurre al minimo le dimensioni del disco.
Posizionare lo specchio quadrato sul tavolino campione dell'obiettivo 1 e regolare lo specchio assialmente fino a quando la dimensione del profilo del fascio non è ridotta al minimo dopo la dicroica. Montare il laser di allineamento facendo scorrere le aste della gabbia nei fori vuoti delle due piastre della gabbia. Utilizzare un supporto per specchio cinematico e uno specchio a discesa per allineare i percorsi dei fasci di allineamento ed eccitazione.
Posizionare lo specchio quadrato assialmente sul tavolino campione dell'obiettivo 1 per ridurre al minimo il profilo del fascio dopo la dicroica. Inserire SL2 e TL2 nel percorso di emissione alle rispettive distanze. Regolare le manopole XY e l'inclinazione dell'obiettivo 2 in modo che il raggio di allineamento rosso passi attraverso il diaframma e il disco di vetro smerigliato.
Regolare la fase di traslazione 2 fino a quando il raggio non forma un piccolo disco di Airy sulla superficie, quindi continuare a regolare la fase di traslazione 2 per ridurre al minimo le dimensioni del disco di Airy. Per ottimizzare il galvo per l'inclinazione nella scansione variante, premere il pulsante FSK sul generatore di forme d'onda per selezionare un segnale d'onda triangolare per il galvo e impostarlo su una bassa frequenza, ad esempio 1 hertz. Osservare la trave di allineamento sulla stessa superficie o parete lontana.
Montare l'obiettivo 3 a circa 4-5 millimetri davanti all'obiettivo 2 con un angolo di 0 gradi e regolare l'altezza in modo che corrisponda. Posizionare un disco di allineamento in vetro smerigliato sul piano focale condiviso tra SL2 e TL2 misurato con un righello. Una volta che la spia di emissione riempie l'apertura posteriore di O3, montare un disco di vetro smerigliato nella posizione approssimativa del sensore della fotocamera e allineare il centro del disco alla luce di emissione che esce da O3. Posizionare TL3 dietro l'obiettivo 3 e regolare l'inclinazione per allineare la luce in uscita con il disco di vetro smerigliato.
Posizionare la telecamera alla distanza misurata dall'obiettivo del tubo e regolare l'obiettivo 3 assialmente dallo stadio di traslazione della gabbia fino a quando il foro non è a fuoco sulla telecamera. Regolare nuovamente l'obiettivo 3 con un angolo di 30 gradi rispetto all'asse ottico dell'obiettivo 2 utilizzando le linee sul tavolo come guida. Rimontare il target di prova della griglia positiva alla stessa altezza assiale e illuminare la griglia con la luce a campo chiaro.
Sposta orizzontalmente la parte a fuoco del campo visivo sullo schermo mentre i quadrati della griglia mantengono una dimensione uniforme. Per allineare il foglio di luce obliquo, posizionare le lenti cilindriche, o CL, in modo che il fascio sia focalizzato in un profilo di foglio orizzontale sul piano focale di CL3. Inserire e posizionare una fessura con orientamento verticale sul piano focale tra CL3 e l'obiettivo 3.
Sul sensore della fotocamera, verificare che il foglio luminoso a 0 gradi appaia sottile e verticale. Utilizzando il controllo motorizzato dello stadio di traslazione, traslare M1 verso le lenti cilindriche per inclinare il foglio luminoso. Inserire il campione di microtubuli marcato con rodamina pre-preparato sul tavolino del campione e regolarlo assialmente in modo che il colorante sia illuminato dal foglio luminoso a cinque diverse profondità tra il centro del campo visivo e il lato destro dello schermo.
Quindi salva ogni immagine. Apri le immagini in Figi. Per ogni immagine, con lo strumento Linea, disegna una linea orizzontale dal centro del campo visivo al centro del foglio luminoso.
Quindi vai su Analizza, seguito da Profilo grafico per calcolare l'angolo del foglio luminoso sopra 01. Dopo aver calibrato lo strumento, montare il campione di microsfere tridimensionali pre-preparato e fare clic sul pulsante FSK sul generatore di funzioni per impostare un'onda triangolare. Per trovare il campione, utilizzare il generatore di funzioni per impostare i parametri a partire da una frequenza di 20 megahertz, un'ampiezza da picco a picco di 400 millivolt e un offset di 0,4.
Scorrere Z manualmente fino a raggiungere il piano di campionamento e ottimizzare l'impostazione Z. Nel programma micromanager, selezionare un tempo di esposizione e aprire la finestra di acquisizione multidimensionale. Impostare l'intervallo su 30 e utilizzare la casella di conteggio per scegliere il numero di fotogrammi.
Una volta impostati i parametri, registrare un time lapse per una scansione completa del volume. Le scansioni volumetriche della rete di microtubuli ricostituiti hanno mostrato che le strutture tridimensionali sono cresciute dense verso il centro, dando luogo a regioni luminose di fluorescenza. Nei piani di imaging vicino al vetrino coprioggetto, la microscopia confocale ha risolto singoli filamenti intorno alla periferia dell'Astar con uno sfondo aggiuntivo verso il centro a causa di segnali fluorescenti fuori fuoco dall'alto.
Tuttavia, lo spostamento di alcuni micron in Z ha rapidamente ridotto la qualità delle immagini a causa delle sezioni dense fuori fuoco dell'Astar. L'illuminazione su un singolo piano del foglio luminoso ha eliminato i segnali sfocati, consentendo una qualità dell'immagine comparabile tra i piani.
