Per iniziare, far crescere il trasformante di lievito selezionato in tre millilitri di terreno SD URA a 30 gradi Celsius fino a raggiungere la saturazione. Misurare la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Centrifugare due millilitri di coltura notturna a 14.000 g a temperatura ambiente.
Pipettare il surnatante. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone MES. Centrifugare la miscela a 14.000 g a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere il surnatante. Dopo aver lavato nuovamente le cellule con tampone MES, risospendere le cellule in due millilitri di tampone MES. Quindi, versare l'intero volume in un serbatoio di reagenti.
Quindi, configurare il lettore per micropiastre. Passare all'icona di gestione del protocollo, quindi impostare il tipo di misurazione sull'intensità della fluorescenza e la modalità di lettura sulla scansione spettrale. Inserire il nome della micropiastra in GREINER 96 F BOTTOM e impostare l'ottica inferiore.
Accedere alle impostazioni ottiche selezionando imposta scansione su emissione. Regolare la lunghezza d'onda di eccitazione a 433 nanometri con una larghezza di banda di eccitazione di 10 nanometri. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda di emissione da 460 nanometri a 550 nanometri con una larghezza di banda di emissione di 10 nanometri e una larghezza di passo di un nanometro.
Impostare il tempo di impostazione su 0.1 secondi. Ora, preparare concentrazioni variabili di soluzione di cloruro di sodio nei pozzetti di una piastra nera a fondo trasparente a 96 pozzetti. Caricare 150 microlitri di tampone MES nei primi tre pozzetti della fila A.Quindi, pipettare 150 microlitri della soluzione di osmolite corrispondente in ordine crescente da sinistra a destra.
Con una micropipetta a 12 canali, pipettare più volte la sospensione di lievito lavata. Quindi, trasferire 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Pipettare il contenuto di ciascun pozzetto più volte per garantire una miscelazione uniforme.
Misurare immediatamente gli spettri di emissione dell'intensità della fluorescenza. Osservare gli spettri di emissione della fluorescenza visualizzati sullo schermo. I costrutti IDR hanno mostrato una combinazione di spettri di emissione mCerulean3 e citrino.
Per AtLEA45, lo stress iperosmotico ha causato un aumento dell'intensità di fluorescenza dell'accettore con una diminuzione dell'intensità di fluorescenza del donatore. Questo non è stato osservato nel costrutto dell'albumina.
