Purificazione delle cellule endoteliali linfatiche murine

Per purificare le cellule endoteliali linfatiche delle urine, utilizzare cellule isolate dal derma murino dopo aver raggiunto circa l'80-90% di co-fluenza, iniziare lavando le perle magnetiche precodificate in un separatore magnetico utilizzando un millilitro di soluzione di rivestimento di perline magnetiche. Risospendere le perle in 150 microlitri di DMEM contenente lo 0,1% di BSA. Successivamente, lavare due volte le cellule nella piastra di coltura tissutale da 60 millimetri con PBS.

Mescolare 50 microlitri di perle coniugate con tre millilitri di DMEM contenente lo 0,1% di BSA e aggiungerlo alle cellule. Sigillare la capsula con biofilm, quindi incubare la capsula su uno shaker agitando a 10 giri/min a temperatura ambiente per esattamente 10 minuti. Scartare il terreno prima di lavare le celle una volta con PBS.

Ispezionare rapidamente le cellule per verificare la presenza di colonie di LEC sulla piastra. Aggiungere un millilitro di tripsina EDTA alle cellule e incubare per tre minuti a 37 gradi Celsius per tripsinizzare le cellule. Ispezionare le celle per verificare che il distacco delle cellule sia riuscito.

Dopo aver neutralizzato la soluzione con due millilitri di terreno LEC completo. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta sterile in polipropilene da cinque millilitri. Utilizzando un separatore magnetico, lavare le cellule con tre millilitri di DMEM contenente lo 0,1% di BSA per rimuovere le cellule non legate.

Risospendere le restanti cellule legate alle perle in un terreno LEC completo e piastrle su piastre di coltura tissutale da 60 millimetri rivestite di collagene. L'imaging in campo chiaro e a fluorescenza ha facilmente identificato le cellule endoteliali linfatiche positive per LYVE1 dopo la purificazione e ha mostrato diverse perle attaccate ad esse. Le cellule mostravano una bassa confluenza 24 ore dopo la purificazione, mentre erano altamente cofluenti, sette giorni dopo la purificazione.