Per iniziare, registrare un timelapse di GFP Rab3 endogena nella zona asinaptica dell'assone DA9 in un Caenorhabditis elegans vivo. Importa il file di dati timelapse nelle Fiji. Quindi verificare la presenza di movimenti o lievi deviazioni dell'animale o del segmento dell'assone durante l'acquisizione dell'immagine.
Utilizza il plug-in StackReg con un'opzione di trasformazione del corpo rigido per correggere qualsiasi movimento o deriva. Utilizzare lo strumento linea segmentata e regolare la larghezza della linea in modo che corrisponda al diametro dell'assone. Fare doppio clic con il tasto sinistro del mouse sull'icona della linea segmentata per tracciare una linea lungo il segmento dell'assone per l'analisi.
Ora utilizzando il plug-in Fiji KymoResliceWide, genera il chimografo, impostando il valore massimo di intensità su tutta la larghezza della linea nelle impostazioni dei parametri. Utilizzando lo strumento linea retta, tracciare gli eventi di trasporto nel chimografo. tracciare i singoli eventi di trasporto e salvare ogni riga nel ROI manager.
Nelle Figi, selezionare i parametri di misurazione come l'area, il rettangolo di delimitazione, il valore medio di grigio e il diametro di Feret. Quindi incolla la tabella dei risultati in un foglio di calcolo per il calcolo. Moltiplica la larghezza per la risoluzione della fotocamera per ottenere la lunghezza della tiratura in micrometri.
Per determinare la durata di un evento di movimento, moltiplicare l'altezza per il tempo di acquisizione tra punti temporali consecutivi. Calcola il tempo di pausa come la durata della corsa tra due movimenti consecutivi in cui la velocità è zero. Normalizza gli eventi totali alla lunghezza totale del chimografo per il numero di eventi al minuto e il segmento di lunghezza dell'assone.
Utilizzando lo strumento Angolo di furetto, categorizza gli eventi in trasporto anterogrado e retrogrado. Per i chimografi generati tracciando la linea segmentata da prossimale a distale, utilizzare l'angolo di Feret per determinare la direzionalità di ciascun evento.