Per iniziare, risospendere il peptide sintetizzato che funge da controllo positivo a una concentrazione di 0,1 milligrammi per millilitro in DMSO. Mescolare il peptide risospeso con il peptide H4 dell'istone biotinilato per creare una curva standard. Successivamente, assemblare le reazioni di acetilazione in duplicato in piastre PCR a 96 pozzetti.
Una reazione di 20 microlitri dovrebbe comprendere 10 microlitri dell'enzima, un microlitro di peptide H4, un microlitro di tampone 20X e un microlitro di DTT. Aggiungere un microlitro di DMSO o il composto in esame in ciascun pozzetto. Pipettare delicatamente la miscela per mescolare.
Quindi incubare la miscela su ghiaccio per 10 minuti per consentire la complessazione degli inibitori enzimatici. Per la continuazione della reazione di acetilazione, unire due microlitri di coenzima A dell'olio di 4-Penten con quattro microlitri di acqua. Aggiungere sei microlitri di questa miscela nei pozzetti.
Dopo aver mescolato delicatamente, centrifugare la miscela a 300 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Incubare il contenuto a 37 gradi Celsius per un'ora in provette tappate. Spegnere il contenuto con 20 microlitri di urea a otto molari e conservare a meno 20 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione.
Successivamente, pipettare 80 microlitri di PBST in ciascun pozzetto di piastre nere a 96 pozzetti rivestite di NeutrAvidina pre-bloccate BSA. Aggiungere 40 microlitri di contenuto di reazione nei pozzetti della piastra. Quindi pipettare i peptidi curvi standard in duplicato nei pozzetti rimanenti.
Agitare delicatamente i peptidi su un agitatore orbitale per un'ora a temperatura ambiente per facilitare il legame. Una volta completato il legame, aspirare il liquido dai pozzetti. Utilizzare una lavapiastre per lavare i pozzetti con 200 microlitri di PBST.
Per la reazione di clic, aggiungere la miscela di rame THPTA all'ascorbato di sodio in acqua e alla biotina azide nel DMSO. Erogare 19 microlitri di reagenti appena miscelati in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra con un foglio di alluminio.
Quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora. Aspirare la soluzione dai pozzetti prima del lavaggio come prima. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di miscela diluita di streptavidina perossidasi di rafano in ciascun pozzetto.
Incubare a temperatura ambiente per un'ora agitando delicatamente su un agitatore orbitale. Per combinare i reagenti di rilevamento Amplex Red, pipettare 500 microlitri di perossido di idrogeno diluito al reagente Amplex Red. Aggiungere 50 microlitri di questa miscela a 4,5 millilitri di fosfato di sodio.
Pipettare 100 microlitri della miscela di reazione Amplex Red ai pozzetti lavati. Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti al riparo dalla luce. Avviare il software SmartControl e fare clic su Plate Out.
Una volta che la piastra è stata trasferita nello strumento, fare clic sull'icona Amplex Red e modificare il layout della piastra. Premere nuovamente l'icona rossa di Amplex per visualizzare il layout modificato. Quindi selezionare i pozzetti standard in alto a sinistra dal layout.
Modificare il nome del file, quindi premere Avvia regolazione. Una volta impostato il guadagno, fare clic su Avvia misurazione. Premere Stato corrente per osservare la misurazione in tempo reale.
Una volta conclusa la misurazione, chiudere la scheda. Quindi fare clic su Apri ultima esecuzione nel pannello superiore. Passare alla scheda Marte.
Quindi premere Esporta in Excel dal menu principale per esportare i risultati dei dati. È stato osservato che i composti A e C inibiscono l'attività di HAT1 di quasi il 100% per diverse diluizioni.
