Per iniziare, attivare il software di imaging. Aprire la finestra Acquisisci. Impostare il tempo di esposizione su 500 millisecondi, l'area della fotocamera su chip pieno e il binning su uno, quindi impostare l'illuminazione per il canale richiesto.
Per l'agitazione citoplasmatica, utilizzare la luce trasmessa per mettere a fuoco il nucleolo dell'ovocita. Per gli esperimenti di speckle nucleare, concentrarsi sulle goccioline di GFP SRSF2. Per ottimizzare la velocità di acquisizione, nella scheda Speciale, impostare l'otturatore della fotocamera su aperto per l'esposizione e la modalità di cancellazione per cancellare la pre-sequenza.
Successivamente, apri la finestra Acquisizione flusso. Nella scheda Acquisizione, impostare la modalità di acquisizione su Stream su RAM e il numero di fotogrammi su 480. Impostare i parametri della fotocamera per acquisire le immagini alla frequenza dei fotogrammi e il numero di fotogrammi da azzerare.
Nella scheda Parametri del controller della fotocamera digitale, impostare lo stato della fotocamera su arresto, il modo otturatore su non aprire mai, il modo chiaro per cancellare la pre-sequenza e il numero di fotogrammi su media a uno. Quindi, regolare un'area di interesse attorno all'oggetto. Nella finestra Stream Acquisition, fai clic su Acquisisci per avviare il filmato.
Dopo l'acquisizione, salvate il filmato come file tiff. Per l'analisi delle immagini, apri ImageJ o Fiji. Nei plugin, fai clic su CIRB e apri il menu Verlhac, quindi seleziona Forma del nucleo dell'ovocita.
Nella finestra di dialogo, selezionare la cartella contenente i filmati da analizzare. Quindi selezionare l'angolo theta e i margini per il ritaglio. Ora, seleziona la calibrazione XY e l'intervallo di tempo, quindi fai clic su OK.To traccia la forma media nel tempo, nel foglio di calcolo, calcola il raggio medio R su tutti i punti temporali T per ogni angolo theta definito.
Per ogni T e theta, sottrai il raggio medio R nel tempo dal raggio minuscolo r. Infine, calcola la media delle fluttuazioni per tutti i punti temporali T e tutti gli angoli theta per ogni nucleo e tutti i nuclei di una condizione. Negli ovociti di controllo, il nucleo mostrava fluttuazioni periferiche significative, come visualizzato con la sonda nucleare YFP Rango.
Al contrario, il nucleo negli ovociti con forze citoscheletriche interrotte è rimasto stabile nel tempo. La varianza della distanza dal centroide del nucleo alla sua periferia ha rivelato un aumento di sei volte degli ovociti di controllo rispetto a quelli con forze citoscheletriche interrotte. Le macchioline nucleari negli ovociti di controllo hanno mostrato una maggiore fluttuazione nelle superfici delle goccioline rispetto alle forze citoplasmatiche interrotte.
