Per iniziare il rivestimento dell'antigene, diluire l'ovoalbumina a cinque microgrammi per millilitro con un tampone di rivestimento. Rivestire una piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione di ovoalbumina per pozzetto durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare i pozzetti cinque volte con PBST.
Bloccare i pozzetti con 250 microlitri di PBST all'1% di BSA a 37 gradi Celsius per due ore. Per preparare una diluizione di siero 1000 X, diluire prima 20 microlitri di siero a un millilitro utilizzando PBST BSA allo 0,5%. Quindi rimuovere 25 microlitri di aliquota sierica e diluirla a 500 microlitri utilizzando 0,5% BSA PBST.
Aggiungere 200 microlitri di siero diluito a 1000 X alla prima fila della piastra rivestita. Quindi aggiungere 100 microlitri di BSA PBST allo 0,5% a tutti i pozzetti tranne i pozzetti della prima fila. Trasferire 100 microlitri dalla prima fila alla seconda fila e mescolare 10 volte.
Per creare concentrazioni variabili di siero per la rilevazione delle IgG, scartare 100 microlitri di liquido dall'ultima fila. Successivamente, diluire la lavanda vaginale dei topi, la lavanda alveolare dei bronchi, i liquidi di lavaggio nasale con PBST allo 0,5% di BSA e il liquido di lavaggio dell'intestino tenue con il 20% di siero di vitello fetale PBST. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.
Lavare i pozzetti cinque volte con PBST. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-topo di capra coniugato HRP nei pozzetti appropriati e incubare a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Dopo aver lavato i pozzetti cinque volte con PBST, aggiungere 100 microlitri di substrato ELISA TMB e incubare in un'area protetta dalla luce per cinque minuti.
Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto a 450 nanometri per terminare la reazione. Misurare l'assorbanza a 450 nanometri su un lettore di micropiastre. Calcolare il titolo anticorpale definendo un valore di risposta positiva pari a 2,1 volte il valore sierico del gruppo di topi di controllo.
Il vaccino adiuvante a nano emulsione ha aumentato significativamente i titoli anticorpali IgG, IgG1 e IgG2a specifici per l'ovoalbumina nel siero. I livelli di IgA specifiche nel liquido di lavaggio vaginale e nel liquido di lavaggio dell'intestino tenue sono stati significativamente aumentati quando l'ovoalbumina è stata adiuvata con acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica.
