Per iniziare, avviare il software del citometro a flusso. Aprire un nuovo esperimento. Aggiungere il numero desiderato di campioni e assegnare loro un nome.
Quindi impostare un istogramma del canale YL2-H o RL1-H, un dot plot dell'area di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione laterale, un dot plot dell'area di dispersione in avanti rispetto all'altezza di dispersione in avanti e un dot plot del canale BL1-H rispetto a VL2-H. Posizionare le cellule di controllo di Trypanosoma brucei wild-type non colorate sulla porta di iniezione del campione e regolare la posizione del tavolino. Per ridurre le dimensioni del file, deselezionare i canali che non devono essere registrati.
Iniziare con una portata bassa per consentire le regolazioni. Quindi fare clic su Esegui per avviare l'acquisizione dei dati. Regolare con precisione la tensione YL2 o RL1 per allineare il picco principale entro 10 alla terza o 10 alla quarta unità di intensità relativa della fluorescenza.
Regolare le tensioni di dispersione diretta e di dispersione laterale per garantire che oltre il 90% degli eventi rientri nell'intervallo del grafico a punti. Impostare la soglia di dispersione in avanti per escludere i detriti senza omettere le celle vitali. Modificare le impostazioni dei canali VL 2 e BL 1 per posizionare il picco primario del controllo wild type non colorato entro 10 rispetto alle due o 10 unità di intensità di fluorescenza relativa.
Fare clic su Registra e misurare almeno 10.000 eventi. Quindi posizionare il primo campione di Trypanosoma indotto, esprimente pHluorin, colorato con ioduro di propidio o rosso tiazolico, sulla porta di iniezione del campione. Anche in questo caso, avviare l'acquisizione dei dati a bassa portata dopo aver eseguito il risciacquo.
Monitorare ogni grafico per assicurarsi che oltre il 90% degli eventi venga catturato correttamente e che i canali VL2-H e BL1-H non siano saturi. Salvare i dati di ciascun campione in formato file FCS e prepararsi per l'analisi.
