Per iniziare, eseguire la citometria a flusso sulle cellule di Trypanosoma brucei che esprimono fluoro. Aprire un nuovo layout e trascinare i file FCS acquisiti nella finestra del layout. Per il gating delle cellule attive, selezionare il controllo wild-type non colorato per aprire una finestra.
Analizza i dati utilizzando gli istogrammi sul canale YL2H o RL2H. In questo caso, utilizzare un istogramma YL2H poiché i campioni sono stati colorati con ioduro di propidio. Successivamente, stabilisci un cancello a due settrici per separare le cellule vive da quelle morte, etichettando il cancello sinistro come vivo e il cancello destro come morto.
Applicare e regolare questo gate su tutti i campioni. Assicurarsi che il punto di iniezione sia disegnato correttamente visualizzando il punto di iniezione su più campioni nel set di dati. Sul controllo wild-type non colorato, fare doppio clic sul cancello attivo.
Imposta l'asse X del dot plot sull'area di dispersione in avanti e l'asse Y sull'area di dispersione laterale. Quindi usa lo strumento Cancello poligonale per delineare la popolazione di celle, etichettandola come celle. Escludere i detriti o le cellule morenti e gli aggregati facendo attenzione alle loro posizioni tipiche nel dot plot.
Applicare il cancello delle cellule sotto il cancello attivo per tutti i campioni, assicurandosi che copra la probabile popolazione cellulare per tutti i campioni. Fare doppio clic sul gate delle celle nel controllo wild-type non colorato per visualizzare gli eventi all'interno di questo gate. Per regolare il dot plot, impostare l'asse X sull'area di dispersione in avanti e l'asse Y sull'altezza di dispersione in avanti.
Identifica la distribuzione diagonale delle singole celle su questo dot plot, distinguendole dai doppietti. Utilizza lo strumento Cancello poligonale per cerchiare gli eventi singoletto, denominando questi singoletti del cancello. Applicare il cancello dei singoletti sotto il cancello delle celle per tutti i campioni, assicurandosi che escluda i doppietti includendo i singoletti e regolare il cancello secondo necessità su campioni diversi.
Sull'esempio di controllo wild-type non colorato, fare doppio clic sul cancello delle singolette. Modificare l'asse X del dot plot in BL1H e l'asse Y in VL2H. Usando lo strumento Cancello poligonale, disegna un cancello diagonale per catturare le cellule fluorescenti al fluoro-2 in VL2 e BL1.
Etichettare questo gate come pHL positivo. Applicare il gate positivo pHL sotto il gate dei singoletti per tutti i campioni. Regolare il gate pHL in modo da coprire le cellule con un'intensità di fluorescenza più elevata rispetto alle cellule autofluorescenti nel controllo wild-type.
Per esportare le statistiche, fai clic sull'editor di tabelle, quindi sulla barra di modifica e, infine, seleziona aggiungi colonna. Incorporare colonne per la conta totale non utilizzata, la conta positiva pHL, la frequenza in tempo reale del totale, la frequenza positiva pHl del genitore, la mediana positiva pHL VL2H e la mediana positiva pHL BL1H. Per regolare le impostazioni di esportazione nell'editor di tabelle, impostare la visualizzazione su file e il testo su CSV.
Selezionare la destinazione e il nome del file, quindi fare clic su Crea tabella. Una graduale lieve acidificazione è stata osservata nel tempo in risposta alla fame, che si è stabilizzata di 90 minuti. Dopo aver reintrodotto il glucosio come indicato dalla linea verde, il pH glicosale è tornato ai livelli pre-fame in 30 minuti, suggerendo che il pH glicosomico è dinamico e regolabile in risposta al glucosio.
