Isolamento di singole cellule da organoidi cerebrali umani per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Per iniziare, raccogli fino a cinque organoidi cerebrali umani generati da cellule staminali pluripotenti indotte in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Aspirare i terreni di coltura in eccesso e lavare gli organoidi una volta con PBS. Usando un bisturi, tritare accuratamente gli organoidi.

Aggiungere la miscela enzimatica agli organoidi tritati e incubare a 37 gradi Celsius con il 20% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica a 90 giri/min per 10-15 minuti. Miscelare la sospensione dell'organoide utilizzando un puntale per pipetta da 1000 microlitri. Quindi aggiungere la miscela di enzimi due e incubare a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti.

Arrestare la dissociazione aggiungendo 10 millilitri di soluzione di arresto. Filtrare la sospensione cellulare su un filtro cellulare da 70 micron. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in quattro millilitri di BSA freddo 0,04%. Ora filtrate la sospensione cellulare su un colino cellulare da 40 micron e contate le cellule su un contatore di cellule. Centrifugare la quantità necessaria di sospensione cellulare, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in NSB plus medium secondo un manuale del kit scRNA-Seq basato sulla microfluidica.