Isolamento di singoli nuclei da organoidi cerebrali umani per il sequenziamento di RNA a nucleo singolo

Per iniziare, trasferisci quattro organoidi cerebrali umani generati da cellule staminali pluripotenti indotte in una piastra a sei pozzetti contenente PBS refrigerato. Tagliare ogni organoide in quattro pezzi. Usando le forbici, taglia la punta di una punta per pipetta da 1.000 microlitri e usala per trasferire pezzi di organoidi in un dosatore da due millilitri.

Aspirare completamente il PBS e aggiungere un millilitro di tampone di lisi NP-40. Schiacciare gli organoidi tre volte con il pestello A seguito dal pestello B. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Lavare il douncer con un millilitro di tampone di lisi e trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga.

Dopo cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione organoide a 500 G per cinque minuti. Aspirare il surnatante lasciando 50 microlitri nel tubo. Aggiungere un millilitro di terreno NSB Plus nel tubo.

E dopo cinque minuti, mescolare per risospendere il pellet. Dopo aver preparato un gradiente di Percoll nella provetta, sovrapporre la sospensione di organoidi. Quindi, centrifugare la sospensione stratificata dell'organoide a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in terreno NSB Plus. Filtrare la soluzione di nuclei su un filtro cellulare da 40 micron. Quindi, colorare i nuclei con DAPI e contarli in una camera di Neubauer.

Centrifugare la quantità necessaria di soluzione di nuclei e risospendere il pellet in terreno NSB Plus secondo un manuale del kit snRNA-seq basato sulla microfluidica.