Per iniziare, coltivare Escherichia coli in 5 millilitri di terreno Luria-Bertani, o LB, in una provetta sterile di polistirene o vetro. Incubare il tubo per una notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min. Sottocoltura: la coltura coltivata durante la notte da 1 a 50 in 100 millilitri LB in un pallone conico.
Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 200 RPM per circa 1,5 ore. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di ceppo fagico T4 ad alto titolo nella coltura di E.coli e incubare a 37 gradi Celsius agitando per tre ore. Una volta che il lisato fagico T4 è limpido, raccoglierli in un tubo conico da 50 millilitri.
Centrifugare i lisati a 4.000 g per 20 minuti per pellettare eventuali batteri e detriti cellulari rimanenti. Sterilizzare il surnatante risultante utilizzando un filtro in nylon da 0,22 micron e raccogliere il filtrato in una nuova provetta da 50 millilitri. Aggiungere 0,1 volumi di cloroformio al lisato fagico T4 filtrato per uccidere i batteri rimanenti e prevenire la crescita batterica.
Vorticare brevemente e incubare il lisato a temperatura ambiente per dieci minuti. Centrifugare il lisato a 4.000 g per cinque minuti per separare il cloroformio dal lisato. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire con cautela lo strato superiore di lisato in una nuova provetta da 50 millilitri.
Aggiungere 13 millilitri di lisato fagico al serbatoio superiore del dispositivo di filtraggio centrifugo da 100 kilodalton. Concentrare il lisato a 4.000 g per cinque minuti o fino a quando la maggior parte del lisato non è passata attraverso il filtro. Utilizzando una pipetta P200 o P1000, pipettare delicatamente i restanti 2 millilitri di lisato su e giù, all'interno del serbatoio superiore, per sbloccare la membrana del filtro.
Gettare il filtrato dal serbatoio inferiore in un contenitore per rifiuti. Ripetere la concentrazione e trattenere circa 2 millilitri di fago concentrato nel serbatoio superiore. Dopo l'ultima centrifuga, pipettare delicatamente il lisato rimanente su e giù, nel serbatoio superiore.
Per lavare il lisato fagico, aggiungere 12 millilitri di tampone salino di magnesio, o SM, al serbatoio superiore e centrifugare a 4.000 g per 10 minuti. Dopo il secondo lavaggio, sospendere nuovamente i restanti 2 millilitri di lisato nel tampone SM fino a un volume finale di 10 millilitri. Trasferire il lisato in una provetta da 50 millilitri e conservarlo a 4 gradi Celsius.
Per rimuovere le endotossine contaminanti, aggiungere 0,4 volumi di 1-ottanolo al volume totale del lisato . Sigillare il coperchio della provetta con pellicola sigillante e agitare a 120 giri/min per un'ora, seguita da incubazione a 4 gradi Celsius per 1,5 ore senza agitare. Centrifugare per separare il lisato eliminato dalle endotossine dall'1-ottanolo.
Rimuovere con cautela la quantità di 1-ottanolo possibile, utilizzando una pipetta P1000, e gettarlo nell'apposito contenitore per rifiuti. Utilizzando un ago calibro 18 e una siringa da 10 millilitri, raccogliere il lisato fagico sotto il restante strato di 1-ottanolo. Trasferire aliquote da 1 millilitro di lisato fagico T4 in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Aspirare rapidamente le provette con i coperchi aperti a 4.000 g per far evaporare l'1-ottanolo residuo dal lisato. Preparare una diluizione seriale del lisato fagico in fattori di 10, quindi individuare 5 microlitri di ciascuna diluizione sulle piastre di agar LB e incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, contare le placche per calcolare le unità di formazione della placca, o PFU.
Diluire il lisato risultante e il tampone SM alla concentrazione desiderata e ritirarsi per confermare. Conservare il lisato concentrato a 4 gradi Celsius fino all'uso.
