Per iniziare, posiziona il topo sottoposto a eutanasia sulla piattaforma chirurgica. Usa le forbici chirurgiche per rimuovere delicatamente le palpebre. Quindi, con l'aiuto di una pinzetta curva, applica una leggera pressione sui lati opposti dell'orbita, facendo sporgere l'occhio verso l'esterno.
Usa il coltello per la cataratta per praticare un'accurata incisione sulla cornea e utilizza una pinzetta curva per estrarre con cura il cristallino. Successivamente, utilizzando una pinzetta curva con punte smussate, trasferire le lenti in un piatto di coltura di plastica da 60 millimetri contenente cinque millilitri di DPBS sterile e gentamicina. Risciacquare delicatamente le lenti con una soluzione DPBS contenente gentamicina.
Dopo aver completato il processo di risciacquo, posizionare l'obiettivo su un pezzo di carta da filtro e lasciarlo asciugare. Una volta che la lente è adeguatamente asciutta, trasferirla con cura sul coperchio di una capsula di Petri per preparare la rimozione della capsula della lente. Quindi ruotare la lente verso l'alto, assicurandosi che il segmento anteriore sia rivolto verso l'alto.
Mentre tieni la capsula anteriore con una pinzetta, usa una pinza per capsuloressi nella mano dominante per creare una piccola lacrima. Tirare delicatamente i due strumenti in direzioni opposte per rimuovere la capsula. Posizionare la capsula in DPBS fino al completamento di tutte le dissezioni della lente.
Successivamente, trasferire con cautela la capsula dell'obiettivo su una piastra a sei pozzetti. Aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina allo 0,05% in ciascun pozzetto per avviare il processo di digestione enzimatica. Agitare delicatamente la soluzione di tripsina per garantire una permeazione uniforme.
Mettere la piastra in un incubatore per colture cellulari e lasciare digerire la capsula per 8-10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi utilizzare le forbici da dissezione per tritare con cura la capsula del cristallino digerita per promuovere la separazione cellulare. Aggiungere 0,5 millilitri del terreno di coltura contenente il 10% di FBS per estinguere la tripsina.
Trasferire i campioni di tessuto in una provetta da centrifugazione e centrifugare a 1000 G per cinque minuti. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Utilizzare un millilitro di terreno di coltura per risospendere le cellule e seminare le cellule in una piastra a 24 pozzetti.
L'immagine di contrasto in fase delle cellule epiteliali del cristallino in coltura ha mostrato che tra il terzo e il quinto giorno, le cellule hanno iniziato la loro fase di proliferazione. Tra il settimo e il decimo giorno si sono potute osservare fasi di crescita rapida e proliferazione logaritmica.
