Per iniziare, aggiungi 264,7 cellule grezze in un piatto di coltura da 100 millimetri e incuba con sei millilitri di DMEM a 37 gradi Celsius con il 95% di umidità e il 5% di anidride carbonica. Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, aspirare il vecchio terreno, quindi lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS riscaldato a temperatura ambiente. Quindi, aggiungi due millilitri di PBS a ciascun piatto contenente cellule e mescolale.
Raccogliere le cellule in due provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri, quindi centrifugare a 377 G per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in due millilitri di PBS. Ora, congelare le provette per microcentrifuga in azoto liquido fino a formare un solido bianco e scongelarle immediatamente a bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Centrifugare le provette a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, prendi due provette da microcentrifuga, una con 100 micromolari di Xanthatin e una con un uguale volume di dimetilsolfossido. Aggiungere 450 microlitri di surnatante centrifugato in ciascuna provetta e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi trasferire 60 microlitri di surnatante da ciascuna provetta da microcentrifuga a 14 provette per PCR. Riscaldare le provette contemporaneamente a temperature variabili per tre minuti con due provette per PCR a ciascuna temperatura. Quindi posizionare le provette nella centrifuga.
Ora, prendi 48 microlitri di surnatante da ciascuna provetta e aggiungili a una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 12 microlitri di tampone di caricamento delle proteine SDS-PAGE a ciascuna provetta. Riscaldare i campioni vortex a bagnomaria a 100 gradi Celsius per cinque minuti.
