Per iniziare, preparare 10 millilitri di tampone di reazione 2X AlkB e sterilizzare attraverso un filtro per siringa da 0,2 micron. In una provetta sterile per PCR, aggiungere 20 microlitri di RNA legati al linker 1, 50 microlitri del tampone di reazione 2X AlkB, due microlitri di AlkB demetilasi, un microlitro di inibitore degli RNA e 27 microlitri di RNA di acqua libera per preparare la reazione di digestione di AlkB. Incubare la miscela di digestione AlkB a temperatura ambiente per due ore per rimuovere la metilazione post-trascrizionale dagli RNA.
Per la separazione in fase pulita, aggiungere 50 microlitri di acqua priva di RNA nella reazione AlkB. Quindi, aggiungi 100 microlitri di miscela di fenolo, cloroformio e alcol isoamilico. Agitare il tubo per 10 secondi.
Centrifugare la miscela di AlkB a 16.000 g per 10 minuti. Trasferire circa 140 microlitri di RNA contenenti lo strato acquoso superiore in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Per rimuovere il fenolo residuo, aggiungere 100 microlitri di cloroformio agli RNA estratti e agitare il tubo.
Centrifugare la miscela a 16.000 G per 10 minuti e trasferire circa 120 microlitri dello strato acquoso superiore in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Dopo la reazione di trascrizione inversa, aggiungere un microlitro di idrossido di sodio a cinque molari nell'ibrido RNA cDNA. Incubare a 93 gradi Celsius per tre minuti per idrolizzare il filamento di RNA dell'ibrido di RNA cDNA.
Quindi, aggiungere 0,77 microlitri di acido cloridrico a cinque molari per neutralizzare la reazione. Preparare un gel di agarosio al 3% in tampone TAE. Mescolare un microlitro di colorante di carico 6X in cinque microlitri di prodotto PCR e caricare il gel con la miscela.
Caricare cinque microlitri di 50 o 100 coppie di basi DNA nel pozzetto prima del primo campione e nel pozzetto dopo l'ultimo campione. Eseguire l'elettroforesi su gel a 120 volt e 400 milliampere per 75 minuti per individuare i prodotti PCR. Dopo l'elettroforesi, posizionare il gel in una scatola e riempirla con acqua deionizzata fino a quando il gel non è completamente immerso.
Aggiungere 10 microlitri di bromuro di etidio nell'acqua. Avvolgere la scatola con un foglio di alluminio e colorare per 30 minuti su uno shaker. Gettare l'acqua contenente bromuro di etidio in una bottiglia di scarto posta in una cappa aspirante.
Sciacquare una volta il gel con acqua deionizzata e gettare l'acqua in una bottiglia di rifiuti. Dopo aver lavato il gel con acqua deionizzata per 10 minuti, utilizzare un gel imager per visualizzare le bande e acquisire un'immagine ad alta risoluzione del gel.
