Per iniziare, prendi colture di 12 giorni di cellule staminali pluripotenti umane che sono state sottoposte a induzione della cresta neurale. Aspirare delicatamente il terreno C dalle cellule. Aggiungere 100 microlitri di PBS per centimetro quadrato di superficie del pozzetto per lavare le cellule, quindi rimuovere il PBS.
Aggiungere un volume uguale di soluzione di distacco cellulare alle cellule e incubare per 30 minuti sotto l'integrazione di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Aggiungere un volume uguale di terreno NCC nella piastra. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in una provetta conica da 15 millilitri.
Far girare le celle a 290 G per due minuti tra 20 e 25 gradi Celsius. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet della cella. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per pipettare 12 millilitri di terreno NCC nel pellet cellulare.
Pipettare meccanicamente la sospensione su e giù per creare una sospensione. Quindi, trasferire la sospensione della cella su una piastra di fissaggio ultra bassa. Il giorno 14, agitare delicatamente le piastre di coltura cellulare per raccogliere piccoli sferoidi al centro di ogni pozzetto.
Utilizzare una micropipetta P1000 per aspirare lentamente il terreno esaurito dalla circonferenza di ciascun pozzetto. Alimentare nuovamente le cellule con il volume originale di terreno NCC. Il giorno 15, rimuovere con cura il mezzo.
Aggiungere PBS ai pozzetti per lavare gli sferoidi. Quindi, rimuovi quanto più PBS possibile, assicurandoti che gli sferoidi non vengano disturbati. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di distacco cellulare per centimetro quadrato di superficie del pozzetto.
Incubare le cellule nella soluzione per 30 minuti sotto il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Con una pipetta sierologica da 10 millilitri, aggiungere un volume uguale di terreno ENC a ciascun pozzetto. Pipettare meccanicamente la soluzione per rompere gli sferoidi rimanenti.
Quindi trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione come prima. Quindi, risospendere le cellule in 5-10 millilitri di terreno ENC.
Contare la concentrazione di cellule vitali utilizzando il blu di tripano e l'emocitometro. Ora, aggiungi un volume sufficiente di terreno ENC per placcare circa 300.000-400.000 cellule vitali per centimetro quadrato di superficie e una densità di circa 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, aspirare le soluzioni dai pozzetti.
Quindi, aggiungere le celle a una piastra con pozzetti rivestiti di laminina PO/FN. Alimentare le celle a giorni alterni con 200 microlitri di terreno ENC per centimetro quadrato di superficie del pozzetto fino ai giorni 30-40. Sfere fluttuanti libere di alta qualità con superfici lisce sono state osservate dopo l'induzione della cresta neurale.
Gli sferoidi esprimevano il marcatore della cresta neurale SOX10. I neuriti sono stati osservati tra i giorni 25 e 30 durante l'induzione del neurone enterico.
