Per iniziare, ottenere il virus chiarificato da cellule in coltura. Posizionare le provette per ultracentrifuga in un rack sul lato di uscita della pompa peristaltica multicanale. Utilizzando una pipetta sierologica, erogare con cura 10 millilitri di virus chiarificato in ciascuna provetta dell'ultracentrifuga.
Quindi, trasferire 22 millilitri della frazione di iodixanolo al 15% in un tubo conico pulito da 50 millilitri. Posizionare i capillari sul lato destro della pompa nel tubo e avviare la pompa. Arrestare la pompa.
Quando la frazione di iodixanolo raggiunge la fine dei capillari sul lato di uscita della pompa, inserire un capillare di uscita in ciascuna provetta di ultracentrifuga con virus chiarificato e avviare la pompa. Arrestare la pompa quando l'ultima frazione del 15% sta per essere immessa nei capillari di ingresso. Successivamente, trasferire 22 millilitri della frazione di iodixanolo al 25% nel tubo conico da 15 millilitri.
Dopo aver acceso la pompa, lasciare che l'intera frazione venga portata nei capillari di ingresso e arrestare la pompa. Se necessario, aggiungere altra frazione del 60% e riempire ogni provetta fino a quando il lisato non forma una cupola sopra la parte superiore ma non trabocca. Arrestare la pompa e rimuovere con cautela il capillare di uscita.
Tappare la provetta per ultracentrifuga con un distanziatore e caricarla in un rotore TI di tipo 70. Dopo la centrifugazione, fissare la provetta per ultracentrifuga a un supporto di supporto. Utilizzando una salvietta priva di lanugine, rimuovere il tappo dalla provetta per ultracentrifuga.
Quindi, collegare un ago calibro 20 a una siringa da 5 millilitri e penetrare nella parete della provetta dell'ultracentrifuga con l'ago a circa 3 millilitri sotto l'interfaccia di iodixanolo al 40 e al 60%. Aspirare lentamente l'interfaccia e parte della frazione del 40%. Tenendo un dito sulla parte superiore aperta della provetta per ultracentrifuga, estrarre la siringa e trasferire la frazione AAV aspirata in una provetta conica da 50 millilitri.
Infine, diluire la frazione virale aspirata due volte nel tampone di lisi AAV fino a un volume di 40 millilitri. Dopo aver lavato un tubo peristaltico, caricare 20 millilitri della frazione AAV diluita in una nuova provetta per ultracentrifuga per il secondo ciclo di frazionamento.
