Per iniziare, prendi 293 cellule FT coltivate in un piatto di 10 centimetri e aspira il terreno. Lavare le celle con cinque millilitri di PBS. Quindi aggiungere un millilitro di tripsina EDTA e incubare per 3-5 minuti a 37 gradi Celsius per staccare le cellule dal piatto.
Dopo l'incubazione, aggiungere nove millilitri di DMEM completo alle cellule per neutralizzare la tripsina. Pipettare ripetutamente su e giù per generare una sospensione omogenea di singole cellule e trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri. Trasferire immediatamente 20 microlitri di cellule in una provetta da 1,7 millilitri e mescolare con 20 microlitri di colorante blu di tripano.
Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Trasferire il volume appropriato di cellule in una provetta da 50 millilitri e diluire in DMEM completo. Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 10% di anidride carbonica durante la notte. Prima della trasfezione, diluire la nanoluciferasi CRAF e i plasmidi dell'alone zeta 1433, insieme a un vettore vuoto pCDNA3 in tampone TE. Etichettare un set di provette sterili da 1,7 millilitri.
Aggiungere 100 microlitri di terreno di trasfezione a ciascuna provetta, insieme ai costrutti di espressione. Ora aggiungi due microlitri di reagente di trasfezione e agita delicatamente per mescolare. Centrifugare brevemente le provette in una microcentrifuga, quindi incubare le provette a circa 25 gradi Celsius per 15 minuti per consentire la formazione di complessi di trasfezione.
Successivamente, aggiungere complessi di trasfezione alle cellule goccia a goccia e incubare a 37 gradi Celsius per 16-20 ore per esprimere l'alone e le proteine nanomarcate.
