Per iniziare, disporre tutto il materiale necessario per il passaggio degli enteroidi intestinali umani, o HIE, sulla piattaforma di lavoro. Mescolare gli HIE con la matrice di coltura 3D ridotta del fattore di crescita. Seminare la miscela su una piastra a 24 pozzetti con tre goccioline da 10 microlitri di matrice di coltura 3D per pozzetto e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi aggiungere 350 microlitri di terreno di coltura HIE. Dopo sette giorni, raccogliere gli HIE da quattro pozzetti in provette da 1,5 millilitri. Centrifugare gli HIE a 2000 g per 40 secondi per rimuovere i detriti.
Utilizzando una pipetta, rimuovere la matrice di coltura 3D in eccesso dalla provetta. Aggiungere 0,5 millilitri di PBS freddo nel tubo. Utilizzando una siringa da insulina da un millilitro, applicare la turbolenza fisica siringando fino a 10 volte per dissociare gli HIE.
Centrifugare gli HIE dissociati a 2000 g per 40 secondi e rimuovere delicatamente il surnatante. Quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per circa tre minuti. Aggiungere la matrice di coltura 3D ridotta del fattore di crescita alla provetta e mescolarla con il pellet.
Semina la miscela di HIE nella matrice di coltura 3D al centro di un piatto rotondo da 35 millimetri. Incubare la capsula a 37 gradi Celsius per 20 minuti per solidificare la matrice di coltura 3D. Quindi aggiungere due millilitri di terreno di crescita organoide intestinale preriscaldato alla piastra e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore.
Il terzo giorno, sostituire il terreno di coltura con due millilitri di terreno di differenziazione preriscaldato e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Il quinto giorno, sostituire il terreno enteroide con due millilitri di terreno di differenziazione preriscaldato e continuare l'incubazione per 24 ore.
