Iniziare rimuovendo dall'incubatrice la piastra contenente HIE differenziati. Per sincronizzare l'orologio molecolare degli enteroidi, aggiungere due microlitri di desametasone 100 micromolari alla capsula e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un'ora. Durante l'incubazione, impostare la percentuale di anidride carbonica e la temperatura del luminometro rispettivamente al 5% e a 37 gradi Celsius.
Dopo la sincronizzazione dell'orologio, rifornire gli enteroidi con tre millilitri di terreno di differenziazione preriscaldato contenente 200 micromolari di D-Lucifero. Posizionare la piastra su un tavolo a otto pozzetti del luminometro in incubazione e coprire il tavolo della piastra campione con il coperchio. Posizionare due camere di umidificazione con un fazzoletto umido o una spugna sulla parte superiore del tavolo del piatto del campione e chiudere il coperchio della macchina.
Sul software di bioluminescenza, fare clic sulla scheda delle condizioni per regolare le impostazioni per il numero di piatti, il tempo di misurazione, l'elaborazione in background e il tipo di filtro. Quindi fare clic su OK per salvare le impostazioni. Per avviare l'esperimento, fare clic sulla scheda Esegui, quindi sul pulsante Avvia.
Quindi fare clic sulle schede filtrate o detrended del rumore grezzo nella parte superiore dello schermo per osservare i segnali per i dati selezionati. Dopo la registrazione, fare clic sul pulsante di arresto per interrompere la corsa. Vai alla scheda file, seleziona Salva con nome e salva i dati in formato Kronos.
Infine, fai clic su file e seleziona Esporta in formato Excel per esportare i dati in un foglio di calcolo. La registrazione in bioluminescenza di a ha valutato la ritmicità circadiana degli HIE in condizioni arricchite con cellule staminali e che inducono la differenziazione. L'analisi della trasformata veloce a quattro anni ha rivelato che, in condizioni differenzianti, la bioluminescenza della luciferasi B MAL one ha mostrato robuste oscillazioni circadiane con una periodicità media di 22,92 ore.
Al contrario, gli HIE hanno dimostrato ritmi circadiani interrotti in condizioni arricchite con cellule staminali.
