Per iniziare, posizionare tutti i materiali necessari per la coltura di cellule HEK 293 nella cappa di biosicurezza pulita. Dopo lo scongelamento, trasferire la sospensione cellulare HEK 293 dal flaconcino a un terreno cellulare preriscaldato da 30 millilitri in una provetta da 50 millilitri. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con l'80% di umidità, l'8% di anidride carbonica e 200 RPM per tre o quattro giorni.
Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare ai 400 microlitri di soluzione blu di tripano allo 0,4% e capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Posizionare 50 microlitri di sospensione cellulare trattata con Trypan Blue sul vetrino dell'emocitometro, contare le cellule vitali totali e calcolare la quantità necessaria di sospensione cellulare per la trasfezione. Aggiungere la quantità necessaria di sospensione cellulare a un terreno cellulare in sospensione preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica all'8%.
Aggiungere 1 milione di cellule per millilitro di sospensione cellulare HEK 293 in 300 millilitri di terreno cellulare in sospensione e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica all'8%. Il secondo giorno, riscaldare il terreno cellulare in sospensione, i plasmidi e il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Aggiungere brevemente i plasmidi al terreno preparato e al vortice, quindi aggiungere brevemente il reagente di trasfezione e il vortice, prima di incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Durante l'incubazione della miscela di trasfezione, contare le cellule coltivate il primo giorno e, se necessario, regolare la densità cellulare tra due e 2,5 milioni di cellule per millilitro. Dopo 30 minuti, goccia a goccia, aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule agitando delicatamente la provetta e incubare per 72-96 ore. Il quinto giorno, aggiungere 33 millilitri di tampone di lisi cellulare 10x alle cellule e mescolare agitando delicatamente.
Incubare la sospensione a 37 gradi Celsius per 1,5 ore con agitazione. Centrifugare la sospensione cellulare a 3.428 G a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Filtrare il surnatante attraverso un filtro sottovuoto in PES da 0,45 micron e raccogliere il lisato chiarificato nel contenitore del filtro.
Aggiungere 90 millilitri di soluzione di PEG 8.000 al 40% a 360 millilitri di lisato cellulare filtrato. Aggiungere l'ancoretta sterilizzata con etanolo al 70% al lisato cellulare e mescolare a 300 giri/min su ghiaccio o in una cella frigorifera per un'ora, quindi incubare per una notte a quattro gradi Celsius senza mescolare.
