Per iniziare, trasferire l'intera coltura del virus adeno-associato precipitato PEG HEK293 in una grande provetta conica. Centrifugare la coltura a 2.820 g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 15 millilitri di PBS con calcio e magnesio.
Trasferire la parte risospesa in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di PBS per raccogliere il precipitato PEG rimanente e trasferire il tutto in una provetta da 50 millilitri. Quindi aggiungere 40 microlitri di DNasi I e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius.
Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro, riempire una provetta di poliallomero di 25 millimetri per 89 millimetri con 15,5 millilitri di lisato cellulare concentrato. Utilizzando una nuova pipetta Pasteur in vetro, infondere delicatamente nove millilitri di soluzione di iodixanolo al 15% sotto il lisato cellulare. Quindi aggiungere cinque millilitri delle soluzioni di iodixanolo al 25% e al 40%.
Infine, aggiungi cinque millilitri di soluzione di iodixanolo al 60%. Utilizzare una siringa per rabboccare il tubo con PBS, assicurandosi che la maggior parte delle bolle d'aria venga rimossa senza disturbare gli strati di iodiosanolo. Sigillare il tubo utilizzando un copritubo elettrico.
Verificare che i diversi strati del gradiente di iodixanolo siano chiaramente visibili. Centrifugare le provette con un rotore non oscillante a 490.000 g per un'ora e 10 minuti a 16 gradi Celsius. Al momento della centrifugazione, assemblare le provette in una fibbia metallica.
Applicare un ago calibro 19 alla siringa. Successivamente, crea una puntura nella parte superiore del tubo utilizzando un ago calibro 30, lasciando l'ago inserito. Forare con cautela il tubo appena sotto l'interfaccia 40%60%iodixanolo, come indicato dall'indicatore rosso fenolo.
Assicurarsi che lo smusso dell'ago sia rivolto verso lo strato del 40%. Rimuovere l'ago calibro 30 con la mano non dominante mentre si estrae lentamente la miscela virus-iodixanolo. Circa a metà, ruotare l'ago in modo che lo smusso sia rivolto verso il basso e continuare l'estrazione, evitando la raccolta dallo strato proteico.
Dopo l'estrazione, trasferire immediatamente la provetta per ultracentrifuga in una provetta da 50 millilitri per scartarla. Aggiungere la sospensione di AAV-iodixanolo raccolta in un tubo da 15 millilitri e diluirlo quintuplicata in PBS, riempiendo fino a 15 millilitri. Trasferire la sospensione in un tubo filtrante centrifugo e centrifugare a 3.428 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius.
Dopo aver scartato il flusso, aggiungere 15 millilitri di PBS 5%saccarosio al filtrato e risuspendere. Raccogliere l'AAV concentrato dal tubo del filtro centrifugo. Infine, conservare l'aliquota del virus a 4 gradi Celsius per un massimo di tre mesi.
