Per iniziare, prendi un vetrino e aggiungi due sottili strisce di nastro biadesivo per prepararti all'imaging. Pipettare circa 10-15 microlitri di terreno di montaggio tra le due strisce di nastro adesivo per il montaggio del cervello. trasferire l'etichetta Drosophila Brains su un vetrino da microscopio con una punta per pipetta P20 presciacquata con PBS e Triton X-100 allo 0,2%.
Una volta che i cervelli sono stati trasferiti, usa un pennello fine per allinearli, assicurandoti che i lobi antennali siano rivolti verso l'alto. Dopo aver orientato i cervelli, coprirli con un vetrino coprioggetti. Quindi, riempire i lati del vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio aggiuntivo.
Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente. Dopo aver asciugato accuratamente il vetrino, conservarlo in frigorifero per l'imaging successivo. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser dotato di un obiettivo a immersione in olio 63X per l'imaging.
Utilizzare un laser argon 488 e un laser elio neon 543 per l'imaging dei glomeruli sinaptici di un lobo antennale e dei neuroni sensoriali olfattivi Or42a. Determinare il guadagno ottico e l'offset per entrambi i canali. Posiziona l'imaging al centro del cervello e concentrati sui glomeruli VM7.
Localizza approssimativamente il buco al centro del cervello. Selezionare la risoluzione dell'immagine di 1024 per 1024. Cattura un'intera proiezione confocale dello stack Z attraverso il lobo antennale per garantire l'acquisizione dell'intera innervazione neuronale Or42a dei glomeruli VM7.
Carica il genotipo o l'immagine in cieco nelle Fiji. Per dividere i canali della linea laser, vai all'immagine, fai clic sul colore e seleziona i canali divisi. Nel canale sensoriale olfattivo Or42a, scorri la pila Z per determinare quali fette contengono l'innervazione neuronale Or42a, identificando l'inizio e la fine della fluorescenza.
Per creare una proiezione di fette di somma che includa solo fette con innervazione neuronale Or42a, fare clic sull'immagine e passare alle pile. Quindi, fai clic su Progetto Z, seleziona le sezioni di somma e inserisci l'intervallo desiderato. Usa lo strumento lazo nelle Figi per tracciare il contorno dell'innervazione del neurone Or42a nel glomerulo VM7.
Moltiplicare la circonferenza dell'area tracciata per il numero di fette Z stack e lo spessore di ciascuna fetta per calcolare il volume di innervazione del glomerulo sinaptico VM7. Dopo 24 ore di esposizione a un veicolo odorizzante di controllo, l'innervazione densa di Or42a MCD:GFP persiste nei glomeruli VM7 di entrambi i lobi antennali. Al contrario, un'esposizione di 24 ore all'odorizzante al 25% di EB provoca una potatura significativa e la perdita del volume glomerulare sinaptico.
L'aumento della concentrazione di odorante EB provoca una potatura dei glomeruli sinaptici progressivamente maggiore. Quantificazioni rappresentative per questo intervallo di concentrazioni di odoranti EB hanno mostrato risultati simili per l'intensità della fluorescenza e il volume di innervazione.
