Per iniziare, accendi la cabina del flusso d'aria laminare, lasciandola stabilizzare per tre minuti. Pulire e igienizzare asetticamente le superfici interne dell'armadio utilizzando i seguenti agenti disinfettanti. Dopo aver disinfettato tutto il materiale che entrerà nell'armadio, posizionare tovaglioli e guanti in nitrile nell'armadio.
Quindi spegnere l'armadio ed esporlo alla luce ultravioletta per 15 minuti. Dopo l'irradiazione, riavviare l'armadio. Metti i reagenti di design del primer in un refrigeratore pieno di ghiaccio.
Dopo averlo sanificato con etanolo al 70%, posizionare il contenitore all'interno dell'armadio. Preparare l'amplificazione isotermica mediata da loop, o miscela LAMP, in una provetta da microcentrifuga da 0,6 millilitri. Pipettare la miscela per omogeneizzarla.
Quindi, incubare le provette chiuse in un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raffreddare i tubi in un refrigeratore di polistirolo riempito di ghiaccio per cinque minuti. Dopo il raffreddamento, posizionare i tubi nella camera a flusso laminare.
Per completare la miscela LAMP, aggiungere quattro microlitri di DNA polimerasi, seguiti da un microlitro di trascrittasi inversa. Per eseguire il rilevamento colorimetrico, aggiungere il blu diidrossinaptolo. Dopo l'aggiunta del reagente, pipettare ciascuna soluzione per miscelare correttamente i reagenti LAMP.
Successivamente, pipettare 22 microlitri di soluzione in provette per PCR, facendo attenzione a non creare bolle. Per il controllo negativo, aggiungere tre microlitri di acqua di pirocarbonato di dietil allo 0,1%. Tenere da parte le provette rimanenti per l'aggiunta di materiale genetico.
Quindi, rimuovere tutti i materiali dall'armadio. Dopo aver sanificato le superfici dell'armadio con etanolo al 70%, spegnerlo. In un'area separata, aggiungere tre microlitri di campione a ciascuna provetta per PCR e pipettare bene con una micropipetta da 20 microlitri per omogeneizzare a fondo.
Prima di iniziare la reazione colorimetrica, utilizzare una fotocamera di alta qualità per scattare foto delle provette PCR. A questo punto, eseguire la reazione utilizzando un termociclatore e un bagnomaria. Per il termociclatore, posizionare i tubi nel blocco di reazione e impostare il profilo termico sull'apparecchiatura.
Se si utilizza il bagnomaria, posizionare saldamente i tubi in contenitori circolari, quindi posizionare questi contenitori nel bagnomaria a 66,3 gradi Celsius per 60 minuti. Trascorso il tempo di reazione, rimuovere i tubi e conservarli a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Se è stata eseguita una reazione colorimetrica, acquisire immagini della PCR con una fotocamera di alta qualità.
Un gradiente di temperatura ha dimostrato che la temperatura di fusione ottimale era di 66,3 gradi Celsius. La concentrazione dell'enzima BST 3.0 è stata ottimizzata a 3,2 unità internazionali per microlitro. Per definire la strategia colorimetrica, è stato valutato il rosso fenolo nei coloranti rossi neutri.
Tuttavia, non è stato osservato alcun cambiamento di colore dopo l'amplificazione. La standardizzazione di diverse concentrazioni di blu idrossinaptolo è stata eseguita con la variazione ottimale che si verifica con 125 micromoli di blu idrossinaptolo. I campioni amplificati hanno dimostrato un cambiamento nel colore in base alla loro concentrazione.
L'amplificazione del campione è stata ulteriormente confermata dall'elettroforesi.
