Per iniziare, posiziona il topo soppresso supino sulla tavola di dissezione. Utilizzando i perni a T di dissezione, fissare i piedini del mouse alla scheda. Con le forbici da dissezione chirurgica, incidere il basso addome e tagliarlo fino al mento.
Dopo aver separato la pelle dal rivestimento peritoneale, allungarla perpendicolarmente lontano dal tronco e fissarla. Utilizzando una pinza smussata, rimuovere con cura i linfonodi cervicali, assiali, brachiali e inguinali, nonché la milza e posizionarli in un colino cellulare da 70 micrometri contenente due millilitri di terreno R9. Per preparare una sospensione a singola cellula, ruotare ripetutamente lo strumento di disgregazione tissutale di mezzo giro in senso orario e antiorario.
Lavare il colino con cinque millilitri di fluido. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugarla. Dopo aver travasato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di tampone lisanti alla provetta per rimuovere i globuli rossi.
Dopo un minuto, mescolare le cellule con 9,5 millilitri di terreno R9. Centrifugare la provetta. E decantare accuratamente il surnatante.
Quindi, risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno di selezione negativo contenente anticorpi anti-MHC2 e anti-CD4 e posizionare il tubo in un bilanciere per 30 minuti. Dopo aver pellettato le celle a 270 G per cinque minuti, decantare il surnatante. Contemporaneamente in un tubo conico da 15 millilitri, lavare 200 microlitri di perle di pecora anti-ratto e immunoglobulina G in sette millilitri a medio.
Posiziona il tubo su un magnete e rimuovi il mezzo. Dopo aver lavato altre due volte, risospendere le perle in sette millilitri di terreno R9. Quindi, mescolare sette millilitri della sospensione di perline con il pellet di cella e incubare il tubo su un bilanciere.
Per rimuovere le cellule legate alle perle di anticorpi, posizionare il tubo conico direttamente sul magnete per tre minuti. Aspirare la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 15 millilitri, mantenendo il tubo sul magnete. Pellettare le cellule CD8 positive arricchite e lavare tre volte in terreno.
